大腸桿菌菌體蛋白質(zhì)殘留量測定法

本法系采用酶聯(lián)免疫法測定大腸桿菌表達系統生產(chǎn)的重組制品中菌體蛋白質(zhì)殘留量。

試劑（1)包被液（P H9.6碳酸鹽緩沖液） 稱(chēng)取碳酸鈉0.32g、碳酸氫鈉0 .5 8 6 g ,置200ml量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度。

(2 )磷酸鹽緩沖液（p H 7 . 4 )稱(chēng)取氯化鈉8g、氯化鉀0.2g、磷酸氫二鈉1.44g、磷酸二氫鉀0.24g，加水溶解并稀釋至500ml, 121°C滅菌15分鐘。

(3 )洗滌液（pH7.4) 量取聚山梨酯20 0.5ml，加磷酸鹽緩沖液至500ml。

(4 )稀釋液（p H 7 . 4 )稱(chēng)取牛血清白蛋白0.5g，加洗滌液溶解并稀釋至100ml。

(5 )濃稀釋液稱(chēng)取牛血清白蛋白l.O g , 加洗滌液溶解并稀釋至100ml。

(6 )底物緩沖液（pH 5 .0枸櫞酸-磷酸鹽緩沖液） 稱(chēng)取磷酸氫二鈉（Na2HP04 . 12H20 )1 . 84g、枸櫞酸 0. 51g，加水溶解并稀釋至100ml。

(7 )底物液取鄰苯二胺8mg、30%過(guò)氧化氫30^1，溶于底物緩沖液20ml中。臨用時(shí)現配。

(8 )終止液lm o l/L硫酸溶液。

標準品溶液的制備  按菌體蛋白質(zhì)標準品說(shuō)明書(shū)加水復溶，精密量取適量，用稀釋液稀釋成每lm l中含菌體蛋白質(zhì)500ng、250ng、125ng、62. 5ng、31. 25ng、15. 625ng, 7. 8125ng的溶液。

供試品溶液的制備  取供試品適量，用稀釋液稀釋成每l m l中約含2 5 0 ug 的溶液。如供試品每l m l中含量小于500ug時(shí)，用濃稀釋液稀釋1倍。

測定法 取兔抗大腸桿菌菌體蛋白質(zhì)抗體適量，用包被液溶解并稀釋成每lm l中含10ug 的溶液，以100ul/ 孔加至9 6孔酶標板內，4 °C放置過(guò)夜（16~1 8小時(shí)）。用洗滌液洗板3次；用洗滌液制備1%牛血清白蛋白溶液，以200u1/孔加至酶標板內，37°C放置2 小時(shí)；將封閉好的酶標板用洗滌液洗板3 次；以100u1/孔加人標準品溶液和供試品溶液，每個(gè)稀釋度做雙孔，同時(shí)加入2 孔空白對照（稀釋液），37°C放置2 小時(shí)；用稀釋液稀釋辣根過(guò)氧化物酶（HRP)標記的兔抗大腸桿菌菌體蛋白質(zhì)抗體1000倍，以100u1/ 孔加至酶標板內，37°C放置1 小時(shí)，用洗滌液洗板1 0次，以l00ul/孔加人底物液，3 7 °C避光放置4 0 分鐘，以5 0 p l /孔加入終止液終止反應。用酶標儀在波長(cháng)4 9 2 n m 處測定吸光度，應用計算機分析軟件進(jìn)行讀數和數據分析，也可使用手工作圖法計算。

以標準品溶液吸光度對其相應的濃度作標準曲線(xiàn)，并以供試品溶液吸光度在標準曲線(xiàn)上得到相應菌體蛋白質(zhì)含量，

按以下公式計算：

供試品菌體蛋白質(zhì)殘留量（％) = (c×n)/（T×106）×100

式中 c為供試品溶液中菌體蛋白質(zhì)含量，ng/ml;

     n為供試品稀釋倍數；

     T為供試品蛋白質(zhì)含量，mg/ml。

注：也可采用經(jīng)驗證的酶聯(lián)免疫試劑盒進(jìn)行測定。

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