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無(wú)菌檢測的風(fēng)險
假陽(yáng)性：結果呈陽(yáng)性，但污染不是產(chǎn)品所帶來(lái)的，而是其他方面，比如測試環(huán)境、方法、人員、操作等方面所帶來(lái)的污染。這種結果帶來(lái)的后果往往是企業(yè)花費大量的人力、物力和財力去進(jìn)行長(cháng)時(shí)間的調查，調查后卻找不到污染的根本原因，整批產(chǎn)品遭到報廢，并且法規禁止不以發(fā)現造成污染的根本原因為目的而只是重復測試的行為。
假陰性：結果呈陰性，但產(chǎn)品本身是存在微生物污染的，是由于微生物受到抑制或傷害沒(méi)有恢復出來(lái)才沒(méi)有生長(cháng)。這種情況下，廠(chǎng)家會(huì )釋放產(chǎn)品，導致的后果有可能是，給藥后，微生物在合適的環(huán)境下大量增殖，病人遭受?chē)乐氐膫ι踔廖：Φ交颊叩纳�。而企業(yè)則會(huì )面臨產(chǎn)品召回，品牌受損甚至工廠(chǎng)關(guān)閉風(fēng)險。
無(wú)菌檢測環(huán)境因素
關(guān)于環(huán)境因素，主要是防止在試驗過(guò)程中的外來(lái)污染對于檢測過(guò)程的影響，防止假陽(yáng)性的出現。尤其是針對于直接接種法和開(kāi)放式薄膜過(guò)濾法的無(wú)菌檢測方法，外部環(huán)境的污染問(wèn)題就成為無(wú)菌試驗假陽(yáng)性的最大可能。因此目前封閉式薄膜過(guò)濾法應用的越來(lái)越多。即便如此，外部環(huán)境的影響仍然對于樣品檢測是非常大的風(fēng)險。目前對于環(huán)境控制的方法主要有兩個(gè)：B級下的局部A級（萬(wàn)級下的局部百級——2010版中國藥典）操作區域，或者隔離器中進(jìn)行無(wú)菌操作。如果操作正確的話(huà)，兩種方式均能夠給我們的實(shí)驗室實(shí)現“近似”無(wú)菌的操作環(huán)境。
潔凈室中進(jìn)行無(wú)菌檢測
對于B級下的A級（國內通常是萬(wàn)級下的百級）操作區域，通常是由層流臺來(lái)實(shí)現的，無(wú)論是垂直層流還是水平層流都能夠滿(mǎn)足我們的無(wú)菌檢驗需求。但是從工作原理上看，生物安全柜并不適合進(jìn)行無(wú)菌試驗。應該定期對于層流臺進(jìn)行檢測，塵埃粒子、風(fēng)速、沉降菌、浮游菌等關(guān)鍵技術(shù)指標以保證該系統處于正常的工作狀態(tài)之中。對于萬(wàn)級設施，應該將其等同視為生產(chǎn)區潔凈室進(jìn)行控制，給局部百級一個(gè)較好的外部環(huán)繞環(huán)境，能夠更好地保證局部百級的運行。
在實(shí)驗過(guò)程中，無(wú)菌的保持也非常重要，特別是防止交叉污染，人員的操作和物品的位置移動(dòng)都會(huì )造成這樣的情況。這就對人員的要求非常高，特別是對于“無(wú)菌意識”的提高，通常是最容易講但是也最難培訓的技能和意識。整個(gè)檢測過(guò)程中一定要注意幾個(gè)原則：
1．物品可以從潔凈的“高級別”到“低級別”轉移，但是不可以從“低級別”到“高級別”轉移。進(jìn)入潔凈室的人員必須經(jīng)過(guò)無(wú)菌穿衣驗證，只有有資質(zhì)的人員才可以進(jìn)入潔凈室。
2．手作為交叉污染的媒介，應該及時(shí)定期對手套使用消毒劑進(jìn)行清潔，如果有微生物污染風(fēng)險較高的操作，應該及時(shí)對手套和無(wú)菌衣進(jìn)行更換。
3．所有需要進(jìn)入實(shí)驗操作區域的物品必須在經(jīng)過(guò)適當處理后才進(jìn)行操作。
4．試驗過(guò)程中一定要注意人的操作對于氣流和待試驗物品的污染。所有物品的去污染化，主要指的是物品的滅菌處理和轉移方式。對于可以進(jìn)行高溫高壓進(jìn)行過(guò)度滅菌的物品，應盡量采取使用這種方式（如果有雙門(mén)消毒鍋可以直接從無(wú)菌室將滅菌完畢的產(chǎn)品取出，如果沒(méi)有雙門(mén)消毒鍋，則需要將滅完菌的物品再次通過(guò)傳遞窗傳入潔凈室），如果該物品無(wú)法進(jìn)行高溫高壓過(guò)度滅菌，則盡量通過(guò)浸泡的方式對表面的微生物進(jìn)行去污染處理（如西林瓶裝的樣品和添加劑等），如果無(wú)法進(jìn)行浸泡，則應該全面地進(jìn)行消毒劑的噴灑和擦拭進(jìn)行外表面的清潔。對于傳入傳遞窗的物品的外包裝，應盡量選用玻璃或者不銹鋼這一類(lèi)的材質(zhì)，盡量減少選用軟袋類(lèi)的材質(zhì)（軟袋類(lèi)材質(zhì)帶有大量的褶皺，很難對所有的外表面進(jìn)行清潔）。
隔離器中進(jìn)行無(wú)菌檢測
對于隔離器，它能夠提供一個(gè)相對較好的操作環(huán)境，由于相對封閉的腔體，加上所有的空氣進(jìn)出均通過(guò)高效過(guò)濾裝置，所有物品進(jìn)出必須經(jīng)過(guò)相應的熏蒸。不同于層流臺，它對于外部環(huán)境也沒(méi)有那么高的要求，對于人員也不需要像潔凈室那樣嚴格的控制。但是它所達到的無(wú)菌環(huán)境的能力要更強于層流臺。當然，在隔離器中進(jìn)行無(wú)菌檢測需要實(shí)驗人員對無(wú)菌實(shí)驗有更好的計劃性，例如每次實(shí)驗前需要有一個(gè)實(shí)驗物品的清單，防止在實(shí)驗過(guò)程中發(fā)現有物品的遺漏。而隔離器本身也需要有完整的滅菌記錄，需要定期的維護保養和驗證試驗。
潔凈室/隔離器環(huán)境監控
單向流空氣區、工作臺面及環(huán)境應定期按《醫藥工業(yè)潔凈室（區）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測試方法》的現行國家標準進(jìn)行潔凈度確認。隔離系統應定期按相關(guān)的要求進(jìn)行驗證，其內部環(huán)境的潔凈度須符合無(wú)菌檢查的要求。日常檢驗還需對試驗環(huán)境進(jìn)行監控。
檢測對象：人員，空氣，設備
檢測方法：浮游菌、沉降菌、表面微生物、塵埃粒子
無(wú)菌檢測方法因素
當進(jìn)行產(chǎn)品無(wú)菌檢查法時(shí)，應進(jìn)行方法適用性試驗，以確認所采用的方法適合于該產(chǎn)品的無(wú)菌檢查。若檢驗程序或產(chǎn)品發(fā)生變化可能影響檢驗結果時(shí)，應重新進(jìn)行方法適用性試驗。對于無(wú)菌檢測的方法設計應考慮到：過(guò)濾性；化學(xué)兼容性，膜的兼容性；沖洗液類(lèi)型及體積；潛在抑制問(wèn)題.
無(wú)菌檢查是根據是否有微生物在液體培養基中生長(cháng)來(lái)進(jìn)行判斷的。培養14天后，觀(guān)察培養基有否變濁。
無(wú)菌檢測方法包括薄膜過(guò)濾法（開(kāi)放式無(wú)菌檢查法及封閉式無(wú)菌檢查法）和直接接種法。
對于直接接種法，藥典中有描述：取規定量供試品分別接種至各含硫乙醇酸鹽流體培養基和改良馬丁培養基的容器中。除另有規定外，每個(gè)容器中培養基的用量應符合接種的供試品體積不得大于培養基體積的10%。實(shí)踐中，有兩種情況會(huì )選擇直接接種法，一種情況是供試品不可過(guò)濾或經(jīng)過(guò)處理后也很難過(guò)濾，從而不能應用薄膜過(guò)濾法，還有一種情況是該品種項中要求用直接接種法來(lái)進(jìn)行無(wú)菌檢查。除此之外都應選擇薄膜過(guò)濾法。
直接接種法的主要優(yōu)點(diǎn)是適用于不可過(guò)濾的樣品；有些醫療器械的無(wú)菌檢查用直接接種法會(huì )比較方便，只需將其浸沒(méi)在培養基中即可。缺點(diǎn)是其屬于開(kāi)放式的操作，容器的滅菌處理，打開(kāi)容器，樣品打開(kāi)包裝，接種等方面樣品、容器、培養基都與外界環(huán)境有直接接觸。風(fēng)險包括會(huì )有污染的風(fēng)險，造成假陽(yáng)性的結果；藥品中或多或少都有一些抑菌的成分，如果用薄膜過(guò)濾法，那么通過(guò)濾膜的過(guò)濾作用加上后續的沖洗步驟，可以盡可能的把這些成分沖洗掉，這樣截留在膜片上的微生物就能得到有效的恢復，而直接接種法做不到這一點(diǎn)；微生物得不到有效的恢復，造成假陰性的結果，樣品直接放在裝有培養基的試管或容器中，會(huì )對實(shí)驗結果的觀(guān)察造成一定的影響。因此，往往需要后續的再轉接環(huán)節；觀(guān)察不到長(cháng)菌的情況，造成假陰性的結果。另外，從操作性上直接接種法也有很大的局限性，通常里面接種的供試品體積不得超過(guò)總體積的10%，那簡(jiǎn)單想一下，如果供試品體積比較大，再加上檢驗數量有一定的要求，那么需要用大量培養基來(lái)進(jìn)行培養。所以通常來(lái)說(shuō)，樣品體積超過(guò)100ml就不能使用直接接種法。從上面的分析可以看出，使用直接接種法有很大的局限性。所以藥典中規定只要供試品性狀允許，應采用薄膜過(guò)濾法。
封閉式無(wú)菌檢查方法設計合理，對供試液，沖洗液和培養基的操作全部都是在封閉的環(huán)境中進(jìn)行，在結果的可靠性和可重復性上無(wú)疑做得更好，實(shí)驗結果出現假陽(yáng)性和假陰性的幾率也低得多，而開(kāi)放式的方法相對操作風(fēng)險大，所以藥典中規定，薄膜過(guò)濾法應優(yōu)先采用封閉式。
無(wú)菌檢測設備和實(shí)驗用品因素
和在普通微生物實(shí)驗室用到的試驗用品有所不同，在選擇適當的試驗物品的時(shí)候需要考慮到無(wú)菌室的特殊性：不可以影響無(wú)菌試驗的效果，也不可以對實(shí)驗室區域的環(huán)境造成任何可能的風(fēng)險。試驗用品的材質(zhì)必須易于清潔而不會(huì )脫落顆粒，特別是會(huì )接觸消毒劑的物品，如剪刀、鑷子和盛放消毒劑的容器，不能夠被腐蝕。當然，對于實(shí)驗用品外部材料的選擇應該盡量避免使用塑料軟袋，物品的滅菌袋子可以選用雙層無(wú)紡布袋子或者一次性滅菌袋。無(wú)菌試驗的時(shí)候還需要考慮的一個(gè)重點(diǎn)就是封閉式無(wú)菌檢測套筒，許多實(shí)驗人員也許知道怎么去選擇培養基，但是很多人并不了解封閉式無(wú)菌檢測套筒的工作原理和基本要求：
1．濾膜的完整性：濾膜的完整性需要從兩個(gè)方面進(jìn)行考慮，一個(gè)是濾膜本身的完整性，一個(gè)是濾膜在裝配在塑料濾杯后的完整性。前者指的是濾膜表面是否具有不同于標示孔徑的微孔的缺陷，主要可以通過(guò)對濾膜本身進(jìn)行起泡點(diǎn)試驗來(lái)得出最大孔徑的數值，如果得出的起泡點(diǎn)試驗數據大于或者小于標稱(chēng)數值，那么說(shuō)明該濾膜本身的孔徑是不符合要求的，過(guò)大的孔徑會(huì )造成微生物的漏過(guò)，過(guò)小的孔徑會(huì )造成微生物在進(jìn)行過(guò)濾的時(shí)候壓力過(guò)大，造成微生物的損傷，這兩種情況都會(huì )造成假陰性的結果；后者的情況比較復雜，主要是由于供應商的生產(chǎn)工藝不良造成的，主要表現是濾膜未能裝配緊固，造成濾膜和濾杯之間會(huì )發(fā)生存在空隙，液體在進(jìn)行過(guò)濾的時(shí)候會(huì )造成樣品未能被濾膜截留而從空隙處流入下游。由于微生物未能夠被濾膜截留，像這種情況就會(huì )造成無(wú)菌試驗的假陰性。
2．呼吸器的完整性：類(lèi)似于濾膜的完整性，也必須考慮呼吸器內濾膜的完整性和濾膜裝配到呼吸器內后的完整性。不同的是，呼吸器的作用是用于過(guò)濾進(jìn)出無(wú)菌檢驗套筒的氣體的，它使用的是0.22μm的疏水性濾膜，它的檢驗是使用擴散流檢測法來(lái)證明它的孔徑。如果呼吸器的孔徑大于0.22μm，或者裝配時(shí)發(fā)生的空隙造成的完整性不佳，會(huì )使得呼吸器失去對空氣過(guò)濾除菌的效果，從而使整個(gè)實(shí)驗過(guò)程暴露在試驗環(huán)境中，將實(shí)驗發(fā)生假陽(yáng)性的風(fēng)險大大提高。
3．濾膜的流速測試：如果說(shuō)濾膜的完整性測試證明了濾膜的最大孔徑，但是這一數值不能夠表征過(guò)濾的效果，那么還需要對濾膜的平均孔徑和開(kāi)孔率的平均效果作一次評估，這個(gè)時(shí)候就必須在標準溫度下使用純化水進(jìn)行流速的測試，來(lái)保證濾膜的平均孔徑和開(kāi)孔率受控（不會(huì )出現濾膜孔徑過(guò)小和開(kāi)孔率不夠導致過(guò)濾壓力過(guò)大而產(chǎn)生的假陰性）。
4．濾膜的截留率試驗：同濾膜的流速測試相對應，還需要了解濾膜的最小孔徑的效果會(huì )不會(huì )過(guò)大而影響截留微生物的效率。
5．整套無(wú)菌檢驗套筒的完整性：在整套套筒裝配完成之后，還需要對于整套產(chǎn)品進(jìn)行完整性測試，證明所有的粘合、超聲波焊接和熱合焊接工藝形成的產(chǎn)品是“封閉式”的，防止有測漏或者破裂的部分導致無(wú)菌試驗被外來(lái)微生物污染從而造成假陽(yáng)性的影響。
6．無(wú)菌性：市場(chǎng)上確實(shí)存在由于滅菌條件的不合理或者包裝的損壞造成的“非無(wú)菌的”無(wú)菌檢測套筒，因此高標準的滅菌工藝和高質(zhì)量的包裝是合格的無(wú)菌檢測套筒的必要條件。
7．微生物恢復生長(cháng)率試驗：根據濾膜的種類(lèi)不同，主要是選擇環(huán)氧乙烷滅菌或者伽馬射線(xiàn)滅菌，但是這不是簡(jiǎn)單地進(jìn)行過(guò)度滅菌就達到的，因為環(huán)氧乙烷滅菌和伽馬射線(xiàn)滅菌都會(huì )有殘留，過(guò)度的滅菌會(huì )使得無(wú)菌檢驗套筒在進(jìn)行無(wú)菌試驗時(shí)產(chǎn)生假陰性的結果。因此，合格的無(wú)菌檢測套筒會(huì )在進(jìn)行無(wú)菌試驗的同時(shí)進(jìn)行微生物的恢復生長(cháng)試驗，以證明殘留的環(huán)氧乙烷或者放射性不會(huì )對微生物產(chǎn)生明顯的影響。
8．耐壓試驗：通常無(wú)菌試驗在進(jìn)行時(shí)套筒內氣體的體積會(huì )被壓縮，因此在試驗過(guò)程中會(huì )積累較大的壓力，我們也應該考量套筒的耐壓性，是否這種套筒在試驗過(guò)程中較大的壓力下能夠保證原有的完整性并且不會(huì )發(fā)生爆裂等影響試驗的后果。以上試驗應該由使用者進(jìn)行試驗證明或者由生產(chǎn)廠(chǎng)家的質(zhì)量保證部門(mén)在進(jìn)行過(guò)恰當的檢驗后出具文件證明。
無(wú)菌檢測培養基因素
應該考慮的可能影響實(shí)驗結果的因素還包括培養基和沖洗液�？梢允褂酶煞叟囵B基自行配制也可以使用成品培養基和沖洗液。這兩者的正確使用與否直接影響到實(shí)驗的結果。通常會(huì )做促生長(cháng)試驗和無(wú)菌試驗來(lái)確認培養基、沖洗液的有效性和無(wú)菌性。進(jìn)行無(wú)菌實(shí)驗室通常還會(huì )使用到一些添加劑，尤其是對于抑菌性比較強的樣品，會(huì )添加一些酶在培養基或者沖洗液中來(lái)抑制殘留的抗生素。所以，這些添加物也是需要保證有效性和無(wú)菌性的，當添加物加入到培養基和沖洗液中時(shí)，必須重新對培養基和沖洗液的有效性和無(wú)菌性重新進(jìn)行測試。無(wú)菌性，促生長(cháng)試驗結果，pH值和外觀(guān)通常是需要進(jìn)行測試的項目。
培養基種類(lèi)包括中國藥典（2010版）中的改良馬丁培養基和硫乙醇酸鹽培養基FTM，以及EP/USP/中國藥典（2015版）中的胰酪大豆胨液體培養基TSB（用于真菌和需氣菌的培養）和硫乙醇酸鹽培養基FTM（厭氧菌和需氣菌培養）。
對于FTM培養基，分裝至適宜的容器中，其裝量與容器高度的比例應符合培養結束后培養基氧化層（粉紅色）不超過(guò)培養基深度的1/2。在供試品接種前，培養基氧化層的高度不得超過(guò)培養基深度的1/5。
培養基適用性實(shí)驗的無(wú)菌性檢查：每批培養基隨機取不少于5支（瓶），置各培養基規定的溫度培養14天，應無(wú)菌生長(cháng)。
靈敏度檢查：
取每管裝量為12ml的硫乙醇酸鹽流體培養基7支，分別接種小于100CFU的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、生孢梭菌各2支，另1支不接種作為空白對照，培養3天。
取每管裝量為9ml的胰酪大豆胨液體培養基7支,分別接種小于100CFU的枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉各2支，另1支不接種作為空白對照，培養5天。
空白對照不生長(cháng)，接種菌液的培養基，應有明顯生長(cháng)。
緩沖液的作用包括溶解、稀釋、潤濕濾膜、沖洗。緩沖液無(wú)菌性檢測的目的是確保沖洗液的無(wú)菌性；無(wú)菌檢查中避免由于實(shí)驗材料造成假陽(yáng)性風(fēng)險。
薄膜過(guò)濾方法：過(guò)濾之后培養觀(guān)察14天，沒(méi)有微生物生長(cháng)（肉眼判斷培養基沒(méi)有渾濁），沖洗液被認為是無(wú)菌的；產(chǎn)品無(wú)菌檢查同步進(jìn)行陰性對照。
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