食品微生物學(xué)檢驗 雙歧桿菌的鑒定

1 范圍

本標準規定了食品中雙歧桿菌（Bifidobacterium ）的鑒定方法。

本標準適用于食品中雙歧桿菌的鑒定。

2 設備和材料

除微生物實(shí)驗室常規滅菌及培養設備外，其他設備和材料如下：

a） 恒溫培養箱：36 ℃±1 ℃；

b） 氣相色譜儀配FID 檢測器；

c） 冰箱：2 ℃～5 ℃；

d） 天平： 感量0.1 g；

e） 無(wú)菌試管：18 mm×180 mm、15 mm×100 mm；

f） 無(wú)菌吸管：1 mL（具0.01 mL 刻度）、10 mL（具0.1 mL 刻度）或微量移液器（200 μL~1000 μL）及配套吸頭；

g） 無(wú)菌錐形瓶：500 mL、250 mL。

3 培養基和試劑

3.1 雙歧桿菌培養基：見(jiàn)附錄A 中的A.1。

3.2 PYG 液體培養基：見(jiàn)附錄A 中的A.2。

3.3 甲醇：分析純。

3.4 三氯甲烷：分析純。

3.5 硫酸：分析純（體積比）。

3.6 冰乙酸：分析純（體積比）。

3.7 乳酸：分析純。

3.8 乙酸標準溶液：吸取分析純冰乙酸5.7 mL，移入100 mL容量瓶中，加水至刻度，標定，標定方法見(jiàn)附錄B，此溶液濃度約為1 mol/L。

3.9 乙酸標準使用液：將經(jīng)標定的乙酸標準溶液用水稀釋至0.01 mol/L。

3.10 乳酸標準溶液：吸取分析純乳酸8.4 mL，移入100 mL容量瓶中，加水至刻度，標定，標定方法見(jiàn)附錄B，此溶液濃度約為1 mol/L。

3.11 乳酸標準使用液：將經(jīng)標定的乳酸標準溶液用水稀釋至0.01 mol/L。

4 鑒定程序

雙歧桿菌鑒定程序見(jiàn)圖1。

5 操作步驟

5.1 樣品制備

5.1.1 樣品的全部制備過(guò)程均應遵循無(wú)菌操作程序。

5.1.2 以無(wú)菌操作稱(chēng)取25 g（mL）樣品，置于裝有225 mL 生理鹽水的滅菌錐形瓶?jì)�，制�?/span>1:10 的樣品勻

液。

5.2 稀釋及涂布培養步驟

5.2.1 用1 mL 無(wú)菌吸管或微量移液器吸取1:10 樣品勻液1.0 mL，沿管壁緩慢注于裝有9 mL 生理鹽水的

無(wú)菌試管中（注意吸管尖端不要觸及稀釋液），振搖試管或換用1 支無(wú)菌吸管反復吹打使其混合均勻，制

成1:100 的樣品勻液。

5.2.2 另取1 mL 無(wú)菌吸管或微量移液器吸頭，按5.2.1 操作順序，做10 倍遞增樣品勻液，每遞增稀釋一

次，即換用1 次1 mL 滅菌吸管或吸頭。

5.2.3 根據待鑒定菌種的活菌數，選擇三個(gè)連續的適宜稀釋度，每個(gè)稀釋度吸取0.1 mL 稀釋液，用L 棒

在雙歧桿菌瓊脂平板進(jìn)行表面涂布, 每個(gè)稀釋度作兩個(gè)平皿。置36 ℃±1 ℃ 溫箱內培養48 h±2 h，培養后

選取單個(gè)菌落進(jìn)行純培養。

5.3 純培養

挑取3 個(gè)或以上的菌落接種于雙歧桿菌瓊脂平板，厭氧，36 ℃±1 ℃ 培養48 h。

5.4 鏡檢及生化鑒定

5.4.1 涂片鏡檢

雙歧桿菌菌體為革蘭氏染色陽(yáng)性，不抗酸、無(wú)芽孢，無(wú)動(dòng)力，菌體形態(tài)多樣，呈短桿狀、纖細桿狀或

球形，可形成各種分支或分叉形態(tài)。

5.4.2 生化鑒定

過(guò)氧化氫酶試驗為陰性。選取純培養平板上的三個(gè)單個(gè)菌落，分別進(jìn)行生化反應檢測，不同雙歧桿菌

菌種主要生化反應見(jiàn)附錄B。

5.5 有機酸代謝產(chǎn)物測定

氣相色譜法測定雙歧桿菌的有機酸代謝產(chǎn)物, 見(jiàn)附錄C。

6 報告

根據鏡檢及生化鑒定的結果（5.4）、雙歧桿菌的有機酸代謝產(chǎn)物乙酸與乳酸微摩爾之比大于1（5.5），

報告雙歧桿菌屬的種名。

附錄 A

培養基

A.1 雙歧桿菌瓊脂培養基

A.1.1 成分

蛋白胨 15.0 g

酵母浸膏 2.0 g

葡萄糖 20.0 g

可溶性淀粉 0.5 g

氯化鈉 5.0 g

西紅柿浸出液 400.0 mL

吐溫80 1.0 mL

肝粉 0.3 g

瓊脂粉 15.0 g～20.0 g

加蒸餾水至 1 000.0 mL

A.1.2 制法

A.1.2.1 半胱氨酸鹽溶液

稱(chēng)取半胱氨酸0.5 g，加入1.0 mL 鹽酸，使半胱氨酸全部溶解，配制成半胱氨酸鹽溶液。

A.1.2.2 西紅柿浸出液

將新鮮的西紅柿洗凈后稱(chēng)重切碎，加等量的蒸餾水在100 ℃水浴中加熱，攪拌90 min，然后用紗布過(guò)濾，校正pH7.0，將浸出液分裝后，121 ℃高壓滅菌15 min～20 min。

A.1.2.3 培養基

將A.1.1 所有成分加入蒸餾水中，加熱溶解, 然后加入半胱氨酸鹽溶液，校正pH 6.8±0.2。分裝后121 ℃高壓滅菌15 min～20 min。臨用時(shí)加熱熔化瓊脂，冷至50 ℃時(shí)使用。

A.2 PYG 液體培養基

A.2.1 成分

蛋白胨 10.0 g

葡萄糖 2.5 g

酵母粉 5.0 g

半胱氨酸-HCl 0.25 g

鹽溶液 20.0 mL

維生素K1 溶液 0.5 mL

氯化血紅素溶液5mg/mL 2.5 mL

加蒸餾水至 500.0 mL

A.2.2 制法

A.2.2.1 鹽溶液

稱(chēng)取無(wú)水氯化鈣0.2 g，硫酸鎂0.2 g，磷酸氫二鉀1.0 g，磷酸二氫鉀1.0 g，碳酸氫鈉10.0 g，氯化鈉2.0 g，加蒸餾水至1000 mL。

A.2.2.2 氯化血紅素溶液（5mg/mL）

稱(chēng)取氯化血紅素0.5 g 溶于1 mol/L 氫氧化鈉1.0 mL 中，加蒸餾水至1000 mL，121 ℃高壓滅菌15min～20 min。

A.2.2.3 維生素K1溶液

稱(chēng)取維生素K11.0 g，加無(wú)水乙醇99 mL，過(guò)濾除菌，冷藏保存。

A.2.2.4 培養基

除氯化血紅素溶液和維生素K1 溶液外，A.2.1 其余成分加入蒸餾水中，加熱溶解，校正pH6.0，加入中性紅溶液。分裝后121 ℃高壓滅菌15 min～20 min。臨用時(shí)加熱熔化瓊脂，加入氯化血紅素溶液和維生素K1 溶液，冷至50 ℃使用。

附錄 B

雙歧桿菌菌種主要生化反應

雙歧桿菌菌種主要生化反應見(jiàn)表B.1。

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