出入境口岸軍團菌檢驗規程

1 范圍

  本標準規定了出入境口岸軍團菌檢驗對象、方法、結果報告、生物安全要求及陽(yáng)性結果判定、處置。

  本標準適用于出入境口岸軍團菌的檢驗。

2 規范性引用文件

  下列文件中的條款通過(guò)本標準的引用而成為本標準的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單（不包括勘誤的內容）或修訂版均不適用于本標準，然而，鼓勵根據本標準達成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是未注日期的引用文件，其最新版本適用于本標準。

  GB19489 實(shí)驗室 生物安全通用要求

  WS195 軍團病診斷標準及處理原則

3 術(shù)語(yǔ)和定義

  下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本標準。

3.1

  軍團病

  軍團菌屬（主要是軍團菌）引起的細菌性呼吸道傳染病，臨床表現有兩種類(lèi)型，非肺炎型和肺炎型。

3.2

  軍團菌

  引起軍團病的病原菌，系兼性細胞內寄生的革蘭氏陰性桿菌，軍團菌是人軍團菌是人軍團病的主要致病菌。

4 實(shí)驗室生物安全防護

  實(shí)驗室結構和設施、安全操作規程、安全設備及個(gè)體防護應符合GB19489中二級生物安全防護實(shí)驗室的要求。

5 對象

5.1 疑似感染軍團菌的出入境人員。

5.2 環(huán)境污染標本。

6 準備

6.1 檢驗試劑

6.1.1 細菌培養鑒定及聚合酶鏈反應（PCR）試劑的制備參見(jiàn)附錄A，或購買(mǎi)符合要求的商品化檢測試劑盒。

6.1.2 直接熒光抗體染色（DFA）、血清學(xué)檢驗及尿抗原檢測見(jiàn)WS195或購買(mǎi)符合要求的商品化試劑。

6.2 儀器設備

  儀器設備參見(jiàn)附錄A。

7 標本的采集和處理

7.1 疑似感染者標本的采集

7.1.1 發(fā)病期患者的痰液、纖支鏡毛刷標本、支氣管灌洗液和肺組織可進(jìn)行病原學(xué)檢測，常規采樣后立即送檢，采樣過(guò)程中應使用無(wú)菌蒸餾水。

7.1.2 無(wú)菌方法采集發(fā)病期患者胸水，用有蓋無(wú)菌試管保存，立即送檢。

7.1.3 用于培養的尿液標本采樣前應清洗并消毒患者尿道口，留取中段尿10ml~20ml，于無(wú)菌容器中，立即送檢。用于尿抗原檢測的標本可常規留取中段尿。

7.1.4 用不抗凝的真空管采集并保存患者急性期（發(fā)病3d內）、第3周、第6周血清用于血清學(xué)檢測。

7.2 疑似感染者標本的處理

7.2.1 肺組織用蒸餾水在無(wú)菌條件下制成懸液，痰液、纖支鏡毛刷標本、支氣管灌洗液、肺組織懸液經(jīng)酸處理或熱處理后進(jìn)行培養（見(jiàn)7.5）。

7.2.2 無(wú)菌方法采集的胸水、消毒尿道口留取的中段尿，血液等正常情況下無(wú)菌的標本無(wú)需處理直接用于培養。

7.2.3 血清學(xué)試驗的血液采集后室溫放置1h后，3000r/min離心5min，，分離出血清。

7.3 環(huán)境污染標本采集

  水樣用于無(wú)菌容器采集200ml~500ml，塵土和泥土用于無(wú)菌蒸餾水制成懸液。水樣中如果含有含氯或其他氧氣指示劑，應在取樣時(shí)或取樣前加入硫代硫酸鉀或相應的活性試劑中和。從樣品采集，濃縮到送檢間隔不超過(guò)2d，實(shí)驗室接到水樣后應盡快進(jìn)行微生物學(xué)分析。

7.4 環(huán)境污染標本處理

7.4.1 膜過(guò)濾法

   采用膜過(guò)濾裝置進(jìn)行膜過(guò)濾，采用直徑47mm~147mm，孔徑0.22μm的膜。過(guò)濾后的膜應放置在帶蓋的無(wú)菌容器中，可用無(wú)菌剪刀剪碎，加15ml的無(wú)菌稀釋液或無(wú)菌蒸餾水，不斷搖動(dòng)至少2min。也可將容器放入超聲波中10，min。

7.4.2 離心法

  取200ml樣品于300nl~500ml容器的離心瓶中，6000r/min離心10min或3000r/min離心30min,保持溫度在15℃~25℃，棄去上清液，將沉淀物懸浮在15ml無(wú)菌蒸餾水中。

7.5 酸處理和熱處理

7.5.1 處理目的

  為減少痰液、纖支鏡毛刷標本、支氣管灌洗液和肺組織懸液等正常情況有菌的標本和環(huán)境污染的標本中的雜菌生長(cháng)，標本需進(jìn)行酸處理或熱處理。同一容器內的標本只能選擇酸處理或熱處理中的一項，兩種處理方法不能重復。

7.5.2 酸處理

  取患者痰液、纖支鏡毛刷標本、支氣管灌洗液和肺組織懸液等標本2ml，轉移至有蓋無(wú)菌試管中。取經(jīng)7.4處理過(guò)的環(huán)境污染標本10ml，轉移至有蓋無(wú)菌試管中，3000r/min離心30min,用無(wú)菌槍頭吸去8ml體積的上清液，通過(guò)渦旋重新懸浮剩余物。每個(gè)裝有2ml標本的有蓋無(wú)菌試管中加入8mlpH2.0酸性緩沖液，混勻，室溫靜置10min。加入堿中和試劑，調至未加酸性緩沖液時(shí)的pH值，靜置10min，待查。

7.5.3 熱處理

  取患者痰液、纖支鏡毛刷標本、支氣管灌洗液和肺組織懸液等臨床標本或環(huán)境污染標本2ml，轉移至有蓋無(wú)菌容器中，50℃±1℃水浴處理30min±2min。

8 實(shí)驗室檢驗方法

8.1 細菌培養鑒定，見(jiàn)附錄B。

8.2 尿液中抗原的檢測，采用免疫層析法，按照相應商品化試劑說(shuō)明書(shū)。

8.3 聚合酶鏈反應（PCR）檢測，參見(jiàn)附錄D。

8.4 直接熒光抗體染色按照WS195.

8.5 血清學(xué)檢測按照WS195或按照商品化試劑說(shuō)明書(shū)。

   注：其他符合檢測要求的商品化試劑盒，在驗證合格后均可參照使用，本標準不做推薦。

9 結果判定與報告

9.1 細菌培養鑒定報告

9.1.1 標本中培養出軍團菌，報告“細菌培養檢出軍團菌”。

9.1.2 BCYEα培養基或GVPC培養基14d內未見(jiàn)可疑菌落，報告“細菌培養14d，位檢出軍團菌”。

9.2 尿抗原檢測報告

9.2.1 尿抗原檢測陽(yáng)性，報告“尿軍團菌抗原陽(yáng)性”。

9.2.2 尿抗原檢測陰性，報告“尿軍團菌抗原陰性”。

9.3  PCR檢驗報告

9.3.1  PCR檢測陽(yáng)性，報告“軍團菌PCR檢測陽(yáng)性”。

9.3.2  PCR檢測陰性，報告“軍團菌PCR檢測陰性”。

9.4 血清學(xué)試驗報告

9.4.1 血清學(xué)試驗陽(yáng)性，報告“軍團菌抗體陽(yáng)性”。

9.4.2 血清學(xué)試驗陰性，報告“軍團菌抗體陰性”。

10 陽(yáng)性結果的處置

10.1 細菌分離培養陽(yáng)性的菌株應傳代保存，疫情報告上級主管部門(mén)，同時(shí)向當地衛生行政主管部門(mén)疾病預防控制中心通報。

10.2 血清學(xué)檢測、尿抗原檢測結果陽(yáng)性或可疑陽(yáng)性的標本，宜選擇直接免疫熒光抗體染色及細菌分離培養和PCR方法進(jìn)行復檢驗證。

附錄A略。

附錄B

細菌培養鑒定

B.1初培養

  將酸處理或熱處理的標本3000r/min離心10min，用無(wú)菌吸管吸棄上清液，保留1ml重新懸浮沉淀物，正常情況無(wú)菌的標本直接用于培養，用無(wú)菌吸管吸取沉淀物懸液或正常的標本，分別滴加1滴~2滴在BCYEα軍團菌專(zhuān)用培養基和GVPC選擇性培養基上，劃線(xiàn)接種或涂布接種。35℃，5%CO2培養箱中培養，連續觀(guān)察3d~7d，軍團菌在BCYEα培養基上菌落通常呈現白色、灰色、藍色、紫色，但也可能出現棕色粉色灰綠色或深紅色。軍團菌表面光滑，邊緣整齊，出現典型的毛玻璃現象。發(fā)現上述菌落即為軍團菌可疑菌落，進(jìn)行下一步分離培養鑒定。無(wú)可疑菌落，培養順延至14d，報告“細菌培養14天，未檢出軍團菌”。

B.2 分離培養

  挑取初培養可疑菌落分別在BCYEα培養基和BCYE-Cys培養基或血平板上劃線(xiàn)接種。35℃，5%CO2培養箱中培養，觀(guān)察2d~4d，在BCYEα培養基上見(jiàn)到菌落形成而BCYE-Cys培養基或血平板上未見(jiàn)生長(cháng)，即初步判定為軍團菌，用軍團菌診斷血清做分型試驗進(jìn)一步驗證。聚合酶鏈反應可輔助用于軍團菌到鑒定，作為參考。

附錄C略。

附錄D略。

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