2015版中國藥典微生物項變化的應對策略—檢驗方法（結束篇）

   隨著(zhù)藥典培訓陸續的展開(kāi)，微生物的專(zhuān)項培訓也在全國如火如荼的舉辦，對于檢驗方法的討論也是授課的重點(diǎn)項目，這次藥典的升級，我們微生物檢驗方法中使用的環(huán)境、培養基、菌種甚至一些關(guān)鍵耗材的均發(fā)生了改變，所以方法適用性試驗避免不了的需要重新進(jìn)行確認。那對于最早8月中旬才能看到藥典最終內容的很多企業(yè)來(lái)說(shuō)，在今年的12月之前把所有出廠(chǎng)產(chǎn)品或原輔料/中間產(chǎn)品的微生物方法適用性試驗進(jìn)行完也是相當不易，甚至是無(wú)法完成的。

  本篇文章著(zhù)重梳理應對藥典生效前后進(jìn)行檢驗方法學(xué)的流程及關(guān)鍵點(diǎn)，由于各企業(yè)各產(chǎn)品的特點(diǎn)不一，內容閱讀前提是貴公司各供試品的方法適用性試驗步驟大家是心里有數的，若還在方法摸索階段請參照15版藥典方法及各類(lèi)培訓及書(shū)籍推薦的方法先進(jìn)行供試液制備方法、濾膜、沖洗量的確定，故本篇文章不對實(shí)驗細節進(jìn)行贅述；同時(shí)簡(jiǎn)述在方法學(xué)完成前后如何對整個(gè)崗位管理類(lèi)和操作類(lèi)SOP進(jìn)行梳理升級。

一、方法適用性試驗前的準備

1、 確認要進(jìn)行方法適用性試驗的供試品

  一般分為出廠(chǎng)產(chǎn)品、原輔料、中間產(chǎn)品等，如果時(shí)間緊張，比如企業(yè)在16年就要再次認證，且需要進(jìn)行驗證的供試品多，建議可以和領(lǐng)導討論進(jìn)行評估，先對出廠(chǎng)產(chǎn)品的方法學(xué)進(jìn)行驗證然后再進(jìn)行原輔料及中間產(chǎn)品的同步驗證，當然這個(gè)需要留下紙面的經(jīng)審核批準的評估結果，對于微生物實(shí)驗室的人來(lái)說(shuō)也是個(gè)執行依據。

  如果不是新建企業(yè)的話(huà)，之前的那些供試品均按2010版藥典進(jìn)行過(guò)驗證，基本上來(lái)說(shuō)可以按之前的供試品制備方法和沖洗量進(jìn)行驗證，那對于實(shí)驗室人員而言，除了實(shí)驗環(huán)境需要重新適應，其余的培養基和菌種只要記得別加錯就好，其實(shí)也是駕輕就熟的，而且實(shí)驗的結果也不會(huì )太令人失望，這里僅指大多數做過(guò)驗證的有檢驗方法的供試品，也會(huì )有部分供試品無(wú)法直接復制，還需前期進(jìn)行方法摸索，但是不論如何都要以嚴肅嚴謹的態(tài)度對待每一個(gè)方法學(xué)的驗證，因為這個(gè)是今后檢驗方法的依據。

2、 確認方法適用性試驗需要的環(huán)境

  這里的環(huán)境包含潔凈室、陽(yáng)性室、隔離器等設備，在進(jìn)行方法適用性試驗前，這些環(huán)境均需要通過(guò)確認合格并滿(mǎn)足方法適用性試驗的環(huán)境條件后方可使用，這里還有個(gè)偷懶的方法，如果隔離器不是今年新買(mǎi)的，之前已對隔離器進(jìn)行確認且已熟悉使用，今年要重新進(jìn)行隔離器的PQ確認，其中的包裝完整性測試也可以和供試品的無(wú)菌檢查方法學(xué)同步進(jìn)行驗證，當然這個(gè)是在實(shí)驗室有一定成功把握的前提下，否則不建議一起驗證，還是老實(shí)點(diǎn)分步進(jìn)行。

3、 確認方法適用性試驗需要的物品

  各供試品方法適用性試驗需要的物品不同，但是供試品、培養基和菌種是肯定要的，在進(jìn)行方法適用性試驗前必須針對每種供試品列出需要物品的清單并經(jīng)所有驗證參與人員確認，這樣便于實(shí)驗時(shí)不遺漏。在供試品量的確認中，必須嚴格按照藥典的檢驗量進(jìn)行。

4、 確認方法適用性試驗參與人員

  理論上來(lái)說(shuō)，經(jīng)過(guò)方法適用性試驗的人員才能進(jìn)行該供試品該方法日常的檢驗工作，但是現實(shí)情況是實(shí)驗室人員流動(dòng)率不低，部分人員并未經(jīng)過(guò)方法適用性試驗，但是在每次方法適用性試驗時(shí)，必須界定現有人員中現有及今后參與該類(lèi)實(shí)驗的人員名單，盡量讓其參與方法適用性試驗的流程中去并且理解整個(gè)驗證過(guò)程的內容和意義，這對于今后開(kāi)展實(shí)驗會(huì )有很大的幫助。

5、 制定方法適用性試驗時(shí)間計劃

  確認了以上4條內容后，并結合實(shí)驗室現有的正常工作就可大致計算出每種供試品方法適用性試驗需要的時(shí)間，必須列成計劃并經(jīng)所有參與人員簽字確認，如無(wú)異常情況應嚴格按照時(shí)間表進(jìn)行驗證，這樣才能保證不影響整體的部門(mén)藥典升級大計劃。

二、方法適用性試驗的實(shí)施

  本次藥典升級在微生物限度檢查和無(wú)菌檢查這2大方法的適用性試驗的流程和判定標準在各類(lèi)培訓中其實(shí)已經(jīng)講的相當詳細了，我就再提一下比較容易忽略的幾個(gè)方面。

1、 無(wú)抑菌性供試品的方法適應性試驗必要性

   曾經(jīng)有次培訓遇到也是藥檢所的老師，哪個(gè)地方的我就不透露了，說(shuō)如果你們企業(yè)能夠確認該供試品無(wú)抑菌性則可以不做微生物計數方法適應性試驗，當時(shí)我就對該觀(guān)點(diǎn)持有保留態(tài)度，這次QC微生物的同事從中檢所舉辦的培訓回來(lái)帶來(lái)的觀(guān)點(diǎn)也恰恰印證了這一點(diǎn)，所謂的對供試品中污染菌的影響并不單單指供試品的抑菌性，還有整個(gè)操作過(guò)程如供試品的制備過(guò)程、沖洗液的種類(lèi)、沖洗量及次數，同時(shí)和使用的濾膜和濾器可能帶有的殘留抗菌物質(zhì)也有關(guān)系，所以保守起見(jiàn)還是建議進(jìn)行方法適用性試驗。

   還有很多同行會(huì )問(wèn)注射用水和純化水是否需進(jìn)行微生物計數方法適應性試驗，這個(gè)的話(huà)我們企業(yè)是不進(jìn)行的，但我沒(méi)有尋求過(guò)檢驗所老師的意見(jiàn)，大家有興趣可以去咨詢(xún)下。

2、 供試品方法適應性試驗的次數

   這里的次數有三個(gè)版本，第一、使用三個(gè)不同批次的供試品，每批各進(jìn)行一次試驗；第二、使用同一批次的供試品，進(jìn)行三次試驗；第三、使用一批次供試品，進(jìn)行一次試驗�，F在沒(méi)有進(jìn)行硬性控制，可以按企業(yè)不同的需求和能力使用風(fēng)險評估的手段得出結論，但是如果三個(gè)不同批次或同批次三次試驗的供試品試驗結果相差較大，則應增加批次供試品參與適用性試驗�，F在國家對于實(shí)驗室的管控沒(méi)有那么教條化，而是根據不同實(shí)驗室的能力水平自行進(jìn)行質(zhì)量風(fēng)險的控制，這也不失于一種進(jìn)步。

3、 無(wú)菌檢查檢驗量的變化

    本部藥典中很明顯的一個(gè)變化就是無(wú)菌檢查檢驗量的調整，計算下來(lái)基本都是增加了檢驗量，特別對于生物制品來(lái)說(shuō)，兩張表很容易看不明白，因為本次生物制品還是三個(gè)套筒，表1是批出廠(chǎng)產(chǎn)品及生物制品的原液和半成品最少檢驗數量，上面寫(xiě)了接種每種培養基的最少檢驗數量，生物制品是20個(gè)；表3是供試品的最少檢驗量，上面寫(xiě)了每支供試品接入每種培養基的最少量，生物制品是半量。那這樣的話(huà)，如何既保證每種培養基的最少檢驗量20支又保證每支供試品接入每種培養基的最少量滿(mǎn)足半量呢，我們本來(lái)就是三個(gè)套筒，那進(jìn)樣死活都是TSB肯定是三分之一量呀，經(jīng)過(guò)好幾次藥檢所的咨詢(xún)，這個(gè)量的問(wèn)題是總量的概念，而不是表面意義上的量，所以如果生物制品是20個(gè)，那供試品的檢驗量最少就是30個(gè)，供試品陽(yáng)性對照的檢驗量是10個(gè)，一次無(wú)菌檢查實(shí)驗的供試品量是40個(gè)，檢驗量這個(gè)大家需要好好去了解和理解一下，避免方法適應性試驗及正式檢驗的檢驗量錯誤。

4、 試驗中的加菌時(shí)機

   在10版的藥典中，不論微生物限度還是無(wú)菌檢查，加菌的步驟都在最后一次沖洗液中，但是15版藥典有了調整，在微生物計數方法中，在試驗組中在供試液中直接加入規定量的菌液，之前一直認為這樣更加真實(shí)的反應了供試品中的微生物在整體試驗中受到的影響情況，但是！在本次中檢所在上海的培訓中，培訓老師也說(shuō)了該方法主要針對平皿法，如果是薄膜過(guò)濾法，如果供試品的抑菌能力并不強的話(huà)建議加在最后一次沖洗液中，還是要看供試品的種類(lèi)定義，無(wú)菌檢查沒(méi)有例外是在最后一次沖洗液中加菌。在最后一次沖洗液中加入陽(yáng)性菌，給出的理由是：第一、主要是增加考慮濾器的有效性；第二、濾器的有效性應由企業(yè)控制，用戶(hù)可采用適當方法抽查（如檢查陽(yáng)性菌液通過(guò)濾筒的流出液）；第三、驗證實(shí)驗主要考慮濾膜/濾器殘留抗菌物質(zhì)對陽(yáng)性菌生長(cháng)的影響，可以與對照濾筒比較而做出判斷，所以驗證試驗中的加菌時(shí)機與方式只要與對照一致即可。這話(huà)又自己圓回來(lái)了，反正還是那句話(huà)各實(shí)驗室見(jiàn)仁見(jiàn)智，最終版本的藥典還是沒(méi)有拿到手之前還是不要先下定論，畢竟檢查的老師很多還是按章辦事的。

   另外這里再說(shuō)一下在隔離器內無(wú)菌檢查加菌的問(wèn)題，因為隔離器內放置的物品都要經(jīng)過(guò)外表面消毒，至少也要經(jīng)過(guò)幾個(gè)小時(shí)，所以不建議提前將帶有菌液的沖洗液帶入，如果試驗不成功無(wú)法證明因為過(guò)程試驗過(guò)程導致，也有可能菌液在室溫放置時(shí)間過(guò)久而致死亡，而且大多企業(yè)也不會(huì )在陽(yáng)性室再買(mǎi)一臺同樣的集菌儀專(zhuān)門(mén)進(jìn)行驗證使用，所以也咨詢(xún)了一些知名外企，他們是在做完整套實(shí)驗后，在陽(yáng)性室使用注射器將規定量的菌液加入制備完的套筒中，但是我也咨詢(xún)過(guò)中檢所的老師，他是建議企業(yè)再購買(mǎi)一臺一樣的集菌儀在陽(yáng)性室完成試驗，所以大家可以根據自己企業(yè)的實(shí)際情況進(jìn)行選擇。

   在這里再提一下方法適用性試驗的意義。無(wú)菌檢查：進(jìn)行供試品無(wú)菌檢查時(shí)，所采用的檢驗方法和檢驗條件應與驗證的方法相同。微生物限度：檢查時(shí)，應按已驗證的計數方法進(jìn)行供試品的需氧菌、霉菌及酵母菌總數的測定，供試品的控制菌檢查按已驗證的方法進(jìn)行，增菌培養基的實(shí)際用量同控制菌檢查方法的驗證。也就是說(shuō)，在正式檢驗供試品之前，該供試品的檢驗方法必須經(jīng)過(guò)方法適用性試驗確定，并按該方法進(jìn)行供試品的檢驗。

三、崗位SOP的梳理和升級

   我們微生物實(shí)驗室有5份管理制度，近40份實(shí)驗操作規程，近20份設備操作規程，因產(chǎn)品比較單一，應該比一般微生物實(shí)驗的文件少一些，但無(wú)外乎就是人機料法環(huán)5個(gè)板塊的內容，其實(shí)在之前的連載中，已經(jīng)把人機料環(huán)都進(jìn)行了較詳細的贅述，所以在方法適用性試驗前，可以對其他板塊的SOP進(jìn)行先行的修訂，當然管理制度應先于操作規程，因為作為綱領(lǐng)性的內容必須先領(lǐng)出整體的管理思路，后續操作規程的方向按照大的管理思路去修訂即可。在藥典還未到手或生效前，已可以根據第三版征訂稿進(jìn)行修訂，再等后續確認內容進(jìn)行核對和微調即可。

   我們微生物實(shí)驗室的文件修訂從15年初就開(kāi)始了，每個(gè)成員均有負責的文件，每月均有必須完成初稿的文件，并在次月對該文件的框架和內容進(jìn)行審核和修改，這樣在后續方法適應性確認后及藥典正式稿確認后，調整的地方就不會(huì )太多。所以建議大家在應對藥典升級的過(guò)程中就可以開(kāi)始對SOP制定升級計劃并逐步實(shí)施了，因為這塊的工作量也是很大的，分散在各個(gè)時(shí)段和各個(gè)檢驗負責人手上，可以讓大家循序漸進(jìn)的將藥典升級的工作融入日常工作并逐步深化藥典的內容，使得應對過(guò)程和結果不流于形式。

   本次是2015版中國藥典微生物項變化的應對策略系列的最后一篇，寫(xiě)這個(gè)連載的初衷還是希望大家不要試圖想在看完這些文章后就可以直接進(jìn)行一些動(dòng)作和實(shí)驗，而是希望大家在熟讀藥典內容并加以理解后，再看這些文章，并對文章中的內容進(jìn)行探討和思考后根據本企業(yè)的特點(diǎn)進(jìn)行藥典升級的準備和應對。這些文章的觀(guān)點(diǎn)僅代表我個(gè)人，很多的觀(guān)點(diǎn)還是比較不全面的，也是希望能夠拋磚引玉讓大家一起討論，而我個(gè)人也在微生物檢驗這個(gè)崗位暫時(shí)止步，調去QA繼續學(xué)習，但是對于微生物的深厚感情讓我還一直在關(guān)心著(zhù)藥典關(guān)于微生物檢驗的各種動(dòng)態(tài)，希望剛進(jìn)入微生物這個(gè)行業(yè)和依然在微生物崗位奮斗的同仁們能夠耐住寂寞，繼續加油！把我們這個(gè)行業(yè)的高度和深度體現和挖掘出來(lái)！

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