食用菌孢子分離

 一、目的要求：
了解食用菌孢子分離的方法，操作技術(shù)以及應用。
二、材料和用具
孢子收集器、75%酒精、0.25%的新潔爾滅、蘑菇、平菇子實(shí)體、接種針等。
三、方法和步驟
在無(wú)菌操作操作下使孢子在適宜的培養基上萌發(fā)，長(cháng)成菌絲體而獲得純菌種的方法稱(chēng)為孢子分離法。其特點(diǎn)是：菌絲菌齡短，因是有性繁殖產(chǎn)物，其菌絲生命力強。侵染病毒的菌類(lèi)可用孢子分離法脫毒。在一般菌種分離中，為了避免異宗接合的菌類(lèi)如香菇、平菇產(chǎn)生單孢子不孕現象，一般都采用多孢分離法。單孢分離法主要應用于食用菌的雜交育種。但雙孢蘑菇、草菇等同宗接合菌類(lèi)可采用單孢分離法。
1．種菇的選擇
在生產(chǎn)中必須選擇優(yōu)良品系中的優(yōu)良個(gè)體作分離材料。
2．孢子采集方法
(1)孢子彈射分離法   它是利用孢子能自動(dòng)彈射出子實(shí)體層的特性來(lái)收集孢子。收集有幾種不同的裝置。
①整菇插種法，需用一套孢子收集器(圖25-1)來(lái)收集孢子，將鐘罩上的孔加上棉塞或包上6~8層紗布，放在墊有4~6層紗布(浸過(guò)0.1%升汞液)的塘瓷盤(pán)上，紗布上放一培養器，內放一個(gè)不銹鋼支架。把收集器包裝好，滅菌備用。將菌幕未破裂的成熟子實(shí)體洗干凈，用0.1%升汞溶液或0.25%的新潔爾滅浸泡2~3min，以殺死表面的雜菌。對于菌幕破裂、子實(shí)層已外露的子實(shí)體或無(wú)菌幕包裹的子實(shí)體，可用棉花蘸75%酒精涂擦子實(shí)體表面消毒。按無(wú)菌操作要求移入孢子收集器，插在支架上，在適宜的溫度中培養。2~3天后孢散落在培養皿中，加入無(wú)菌水，用針筒吸取孢子液，接種在斜面培養基中央，置于22～26℃恒溫箱中培養即可。
②鉤懸法（圖25—2），在生產(chǎn)上，采集木耳、銀耳孢子常用此法，傘菌也可采用此法。先將新鮮成熟的耳片用無(wú)菌水沖洗，然后用無(wú)菌紗布將水吸干，取一小片掛在滅菌的鉤子上（傘菌則消毒后掛上），鉤子的另一端掛在三角瓶口，瓶?jì)妊b有培養基，在25℃下培養24h。孢子落到培養基上后，取出耳片，塞上棉塞繼續培養，然后再轉入試管中培養。
③貼附法，取一小塊成熟的菌褶或小塊菌蓋，用溶化的瓊脂或膠水、漿糊(需先滅菌)貼附在試管斜面的上方或培養皿皿蓋上，經(jīng)6-12h，待孢子落下后，立即將試管或培養皿中的培養基移到另一消毒過(guò)的空試管或培養皿中進(jìn)行培養。
(2)菌褶上涂抹法
將傘菌手實(shí)體用75%酒精表面消毒，按無(wú)菌操作用接種環(huán)直接插入兩片菌褶之間，輕輕地抹過(guò)褶片表面，然后用劃線(xiàn)法涂抹于試管培養基上。
(3)孢子印分離法
取成熟子實(shí)體經(jīng)表面消毒后，切去菌柄，將菌褶向下放置于滅過(guò)菌的有色紙上，在20～24℃靜置一天，大量孢子落下形成孢子印，然后移少量孢子在試管培養基上培養。
(4)單孢子分離法
進(jìn)行單孢子分離后，在人工控制的條件下，便兩個(gè)優(yōu)良品系的單孢子進(jìn)行雜交，從而培育出新品種。
①平板稀釋法，挑取少許孢子在無(wú)菌水中形成孢子懸浮液，取幾滴涂于培養基上，用無(wú)菌玻璃三角架推平。經(jīng)48～72h后，鏡檢孢子萌發(fā)情況。在單個(gè)孢子旁做好標記，然后將其轉接到斜面培養基上，待菌落長(cháng)到1cm左右時(shí)進(jìn)行鏡檢，觀(guān)察有無(wú)鎖狀聯(lián)合，初步確定是否是單核菌絲。
②連續稀釋法，挑取一定量孢子，經(jīng)連續稀釋后，直到每滴稀釋液中只有一個(gè)孢子，然后滴入試管中保溫培養。當發(fā)現單個(gè)菌落時(shí)，轉到新試管中繼續培養，并通過(guò)鏡檢以確定是否為單孢菌落。
  
   

 

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