生淀粉酶細菌菌株的篩選及其酶學(xué)性質(zhì)研究

生淀粉糖化酶一般指可以直接作用、水解或糖化未經(jīng)蒸煮的淀粉顆粒的酶，可能包括α-淀粉酶、β淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、普魯蘭酶。它可以將淀粉傳統工藝中的糊化、液化和糖化合并為一步直接進(jìn)行糖化，如果將其應用于無(wú)蒸煮的酒精發(fā)酵，可節約總能耗的30%~40%。已發(fā)現的能產(chǎn)生淀粉酶的微生物種類(lèi)較多，報道最多的是黑曲霉、根霉和芽孢桿菌。本文篩選出能產(chǎn)生淀粉酶的細菌，對其進(jìn)行初步鑒定，并進(jìn)行了酶學(xué)性質(zhì)的研究。

1   材料與方法

1.1  土樣

     校內食堂垃圾附近的土壤。

1.2  培養基

     平板分離培養基：可溶性淀粉3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、瓊脂20g、蒸餾水1000ml，pH7.2~7.4,121℃滅菌20min。其中可溶性淀粉在105℃下干熱滅菌2h，然后在65℃下無(wú)菌操作加入。

液體發(fā)酵培養基：可溶性淀粉3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、蒸餾水1000ml，pH7.2~7.4,121℃滅菌20min。其中可溶性淀粉在105℃下干熱滅菌2h，然后在常溫下無(wú)菌操作加入。

1.3 菌種篩選方法

    初篩：變色圈法，選擇圈徑比較大的菌落，進(jìn)一步劃線(xiàn)分離后，進(jìn)行產(chǎn)酶測定。

    復篩：測酶活，選擇酶活高的菌株作為目的菌株。

1.4 生淀粉酶活的測定方法

    酶活力測定方法：將發(fā)酵液在4℃，8000r/min下，離心30min后取出上清液，再通過(guò)抽濾得到的濾液為粗酶液，取1ml粗酶液，加入到19mLpH6.5的檸檬酸鹽緩沖液中，再加入0.5g的可溶性淀粉為底物，30℃水解2h后用0.5ml4%的NaOH溶液終止反應，反應液在4000r/min下離心5min，用DNS法測定上清液中還原糖的含量，測定540nm處的吸光度（在酶活測定體系中，以純水取代粗酶液作為空白），查葡萄糖標準曲線(xiàn)得到水解產(chǎn)物中的葡萄糖量，從而確定生淀粉酶的酶活力大小。

酶活力定義：在pH6.5、溫度為30℃保溫120min條件下，1min產(chǎn)生1ug葡萄糖所需要的酶的量規定為1個(gè)酶活力單位（U）。

1.5 菌種鑒定

   進(jìn)行形態(tài)和生理生化檢測。

1.6 生淀粉糖化酶的酶學(xué)性質(zhì)研究

1.6.1 酶的熱穩定性研究 取一定量的粗酶液，分別在50℃、60℃、70℃和80℃不同溫度下保溫60min，每隔10min測定殘留酶活力。

1.6.3 pH的影響  配制pH分別為3.0、3.6、4.0、4.6、5.0、5.6、6.0、6.6、7.0、7.6、8.0和8.6的檸檬酸鹽緩沖液，在不同pH緩沖液中讓酶水解生淀粉，通過(guò)水解產(chǎn)物中葡萄糖的量計算酶活力的大小。

1.6.4 酶的pH穩定性研究  將酶溶于pH6.5的檸檬酸鹽緩沖液中，分別放置1、2、4、6、9、12、24、36、48和60h后，測定殘余物的酶活力大小。

1.6.5 金屬離子的影響  以不加金屬離子為對照，分別在反應液中加入1mmol/L的Ca2+、Na+、Mg2+、Fe3+、K+、Mn2+、Zn2+和Cu2+，測定酶活。

2  結果與分析

2.1 菌種篩選

    從初篩平板上挑出了8株有較大淀粉水解圈的菌株，分別編號為QD001到QD008。測得它們各自的圈徑比見(jiàn)表1，對圈徑比較大的菌株QD001、QD006和QD007做斜面保藏并通過(guò)搖瓶復篩，得到QD006酶活力最高，達到10、18U/ml，確定為目標菌株。

2.2  菌種鑒定

     QD006的菌落較小，較薄，較透明且“細膩”，邊緣光滑，革蘭氏染色確定該菌為革蘭氏陽(yáng)性菌，經(jīng)顯微觀(guān)察呈球形，為球菌；糖類(lèi)發(fā)酵試驗顯示改菌能利用葡萄糖，蔗糖，但不能利用乳糖：VP試驗為陰性；MR試驗為陰性；吲哚試驗為陰性；檸檬酸鹽為陰性。初步鑒定該菌為Staphylococcus intermedius。

2.3生淀粉糖化酶的酶學(xué)性質(zhì)

2.3.1 溫度對酶活的影響

   由圖1可知，酶的最適作用溫度為50℃。當溫度小于50℃時(shí)，反應速率隨溫度升高而升高，但高于最適溫度，酶的反應速率下降。

2.3.2 生淀粉糖化酶的熱穩定性

    由圖2可知，該生淀粉糖化酶在50℃和60℃時(shí)，放置1h后，殘余酶活分別是99.8%和98.2%，由此可知，在60℃內，該生淀粉糖化酶具有很好的熱穩定性。

2.3.3 pH對酶活力的影響

    由圖3可知，該酶的最適為6.5左右，同時(shí)可以看出pH在3-4.5的范圍內，生淀粉糖化酶的酶活變化不大，上升趨勢比較小，但pH對生淀粉糖化酶的影響呈現出明顯的鐘罩形。

2.3.4 酶的耐酸穩定性

    由圖4可知，該生淀粉糖化酶在pH6.5的檸檬酸鹽緩沖液中放置1、2、5h后，殘余的酶活力都在70%以上，隨著(zhù)放置時(shí)間的延長(cháng)，酶活力迅速降低，放置60h，殘余的酶活力僅在10%左右，所以該酶的耐酸穩定性比較弱。

2.3.5 金屬離子對生淀粉糖化酶的酶活力的影響

由表2可知，Ca2+、Na+、K+、對該生淀粉糖化酶有激活作用，Fe3+、Zn2+、Cu2+ 對該酶有抑制作用。

3  結論

   從自然界分離得到產(chǎn)生淀粉酶的菌株QD006，通過(guò)形態(tài)和生理生化鑒定，初步確定為Staphylococcus intermedius，經(jīng)對該酶酶學(xué)性質(zhì)的研究，其最適溫度為50℃，最適pH為6.5，并且具有良好的熱穩定性，Ca2+、Na+、K+、對該生淀粉糖化酶有激活作用，Fe3+、Zn2+、Cu2+ 對該酶有抑制作用。

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