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二、微生物鑒定系統
前幾年，很多微生物實(shí)驗室在調研購買(mǎi)何種類(lèi)型的微生物鑒定系統，我們實(shí)驗室的鑒定設備是使用生化方法鑒定的設備（表型鑒定），相信現在大多數的實(shí)驗室還是在使用生化方法去進(jìn)行鑒定，不論使用設備或者API等手工板條進(jìn)行鑒定，也有部分實(shí)驗室使用分子方法（PCR+測序）進(jìn)行鑒定，但礙于方法的局限、菌庫的數量及鑒定的程度，實(shí)際檢出率和準確率都不是很理想。
《9204微生物鑒定指導原則》的內容對于現在大多數的藥企針對性和指導性都很強，其中介紹的技術(shù)包含了現在藥企實(shí)驗室可用的幾乎所有的鑒定方法，個(gè)人覺(jué)得這篇指導原則是微生物指導原則中的干貨，指導原則中的內容就不在本文中多加贅述，以下簡(jiǎn)單介紹一下微生物鑒定方法及微生物設備的選型。
1、鑒定方法簡(jiǎn)介
微生物鑒定原則：表觀(guān)水平→生化水平→分子水平，微生物鑒定應遵循逐步縮小范圍的原則，依據分類(lèi)學(xué)知識，將微生物逐步落實(shí)到科、屬、種。
各類(lèi)微生物的菌落特征就不在這里列表了，在很多微生物書(shū)籍中均有介紹，進(jìn)行微生物鑒定的人員應對各類(lèi)型微生物的形態(tài)特征做到心中有數。不管使用何種方法進(jìn)行微生物鑒定，都應對微生物進(jìn)行純化，至少分離到純培養物后再進(jìn)行后續鑒定。
現有的鑒定技術(shù)分為表型鑒定、基因型鑒定和色譜光譜鑒定。表型鑒定基于表觀(guān)生物學(xué)活性，如營(yíng)養物質(zhì)代謝試驗、碳源和氮源利用試驗、各種酶類(lèi)試驗、API試驗條等；基因型鑒定基于核酸物質(zhì)，如16SrRNA分型、核糖體分型和脈沖場(chǎng)電泳試驗；色譜光譜鑒定基于全細胞信息，如傅里葉變換紅外技術(shù)。
1） 初篩試驗
流程基本就是分離純化→革蘭氏染色（芽孢染色、KOH拉絲試驗）→生化篩選（氧化酶、觸酶、凝固酶）→根據上述結果篩選板條→孵育規定時(shí)間人工讀數或機器讀數→結果對比系統中的標準微生物特征得出鑒定結論。
革蘭氏染色鏡檢對于鑒定人員的技術(shù)及判斷經(jīng)驗有一定要求，這步是很關(guān)鍵的一步，但這個(gè)沒(méi)有捷徑必須是多做才能總結經(jīng)驗的，很多時(shí)候一些球桿菌、芽孢菌等的形態(tài)和染色結果均依賴(lài)鏡檢人員的經(jīng)驗，有些在無(wú)法判斷的情況下，可以使用KOH拉絲實(shí)驗進(jìn)行輔助判斷，但我們實(shí)驗室不用其判定革蘭氏染色結果，大多數革蘭氏陰性菌在5-10S內出現陽(yáng)性反應，有的則需30-45S，假單胞菌、無(wú)色桿菌、黃桿菌、產(chǎn)堿桿菌等大多數在10S內呈陽(yáng)性，不動(dòng)桿菌、莫拉菌反應較慢，大多數菌株在60S內出現陽(yáng)性，而革蘭氏陽(yáng)性菌在60S以后仍為陰性，其主要用于革蘭氏陰性菌與易脫色的革蘭氏陽(yáng)性菌的鑒別。
生化篩選中的三種方法，氧化酶試驗是將革蘭氏陰性桿菌分為非發(fā)酵菌（如假單胞菌）及腸道菌（如腸桿菌科）；觸酶試驗，也叫過(guò)氧化氫酶試驗，用于革蘭氏陽(yáng)性球菌的鑒別，葡萄球菌和微球菌呈陽(yáng)性反應，鏈球菌及腸球菌呈陽(yáng)性反應，但是需要注意的是腸球菌多假陽(yáng)性情況；凝固酶試驗，區分致病性及非致病性葡萄球菌，金黃色葡萄球菌多陽(yáng)性。
初篩試驗是鑒定的最關(guān)鍵步驟，若結果錯誤會(huì )影響后續試驗，包括微生物鑒定試劑盒和引物的選用。
2）表型鑒定
這里必須介紹下生化鑒定的始祖API試條，這個(gè)相信很多實(shí)驗室還在使用，是全手工的方法，流程是接種物的制備（以上的生化鑒定全部完成）→試驗條的篩選（根據之前生化鑒定結果選擇）→試驗條的接種→試驗條的判讀。這個(gè)方法其實(shí)很多實(shí)驗室即使買(mǎi)了設備也沒(méi)法擯棄，如果設備壞了還是需要手工方法進(jìn)行試驗，成本相對低廉，15種試條可鑒定細菌550種，但是人工判讀結果的有較大誤差（看色判讀），也是需要相當經(jīng)驗值，我們實(shí)驗室如果碰到判讀有異議，一般會(huì )由2人一起對結果進(jìn)行判斷，達成一致后再輸入鑒定結果。
表型微生物鑒定太依賴(lài)于其本身的表型特征，實(shí)驗室很多時(shí)候在初次鑒定時(shí)的結果并不理想，在二次鑒定時(shí)得出可接受的鑒定結果，從初始培養物中剛分離出的受損的次代培養物可能不能進(jìn)行完整的基因表達。
在指導原則中提到“表型微生物鑒定方法已廣泛應用于藥品微生物實(shí)驗室，根據微生物表型鑒定所提供的信息可以判斷藥品中污染的微生物種類(lèi)，也可掌握環(huán)境微生物菌群的變化，并進(jìn)行產(chǎn)品的風(fēng)險評估。在許多質(zhì)量控制調查中，單獨的表型鑒定結果就能給出充足的信息幫助調查人員進(jìn)行深入調查，并按需要制定適宜的糾正措施�！痹擃�(lèi)鑒定方法雖有一定局限性，但是是最常用的鑒定方法。
3）基因鑒定
基因相較于表型來(lái)說(shuō)差異相對比較少見(jiàn)，且基因型的明顯差異說(shuō)明其并非同種或同屬，理論上，基因型微生物因核酸序列高度保守所以其鑒定結果更可靠，其通常不受生長(cháng)培養基等的影響，只需分離到純菌落便可用于分析。
最常用的方法就是通過(guò)比較細菌16SrRNA或真菌8SrRNA基因的部分堿基序列來(lái)實(shí)現，即經(jīng)過(guò)PCR進(jìn)行基因擴增、電泳分離擴增產(chǎn)物、以雙脫氧鏈終止法進(jìn)行堿基測序，然后與數據庫進(jìn)行比對，有的微生物實(shí)驗室直接使用該方法進(jìn)行鑒定。我們實(shí)驗室也正在進(jìn)行生化鑒定和該方法的比較試驗，日常使用生化方法，關(guān)鍵事件的調查準備兩者結合使用或委外使用色譜方法進(jìn)行綜合鑒定。
當然，基因型鑒定雖然比表型鑒定的準確率和檢出率會(huì )有一定提高，但是基因型數據也有一定的局限性。鑒定系統同樣不能鑒定所有的微生物；需要昂貴的分析設備和耗材；通常僅有關(guān)鍵的微生物調查才會(huì )應用；僅憑基因型數據作出的決定，對于考慮微生物特征，測試歷史及微生物來(lái)源是沒(méi)有意義的；當今伯杰氏手冊中的分類(lèi)學(xué)手段基于遺傳物質(zhì)并非遵循表觀(guān)水平，導致一些已知的微生物分類(lèi)學(xué)發(fā)生改變及重命名（如黑曲霉ATCC16404）。
在指導原則中提到 “基因鑒定法不但技術(shù)水平需要保證，還需要昂貴的分析設備和材料，通常僅在關(guān)鍵微生物調查中使用，如產(chǎn)品不合格調查。若使用，方法必須經(jīng)過(guò)確認�！彼匀羰褂没蜩b定的方法一定要進(jìn)行方法確認，確認的方法在指導原則中有詳細描述。
2、設備選型
在選擇是否購買(mǎi)設備、買(mǎi)何種設備前，必須了解各類(lèi)鑒定原理。很多人會(huì )問(wèn)哪個(gè)技術(shù)更好，越是后端發(fā)展的技術(shù)越是鑒定的準確那是無(wú)疑的，而且有些設備可以進(jìn)行溯源調查，這也是大家對于OOS結果調查中希望開(kāi)發(fā)的模塊，當然傳統的生化也不用摒棄，可以結合一些表型鑒定對鑒定結果進(jìn)行分析和判斷。
設備選型至少應考慮以下幾點(diǎn)：預算、設備菌庫量、設備一次最大檢驗量、檢驗時(shí)間、檢驗過(guò)程復雜性、檢驗結果溯源性、做1TEST的成本、設備的維護成本等，以下挑重點(diǎn)項討論。
預算的多少其實(shí)直接決定了選擇哪個(gè)鑒定原理的設備，現有鑒定儀器的實(shí)驗室基本買(mǎi)的都是表型鑒定設備，價(jià)格比較能夠接受，其他方法設備相對較昂貴，有溯源功能的設備價(jià)格更甚，后續的實(shí)驗成本也不便宜。企業(yè)可以根據預算量進(jìn)行考慮，但是基因及色譜光譜法一定是菌鑒發(fā)展的趨勢。
菌庫量是必須要考慮的問(wèn)題，很多設備的銷(xiāo)售會(huì )對外宣傳他們設備的菌庫量很大，聽(tīng)到這樣的介紹我們先要冷靜，先確定其菌庫是否是指臨床的菌庫，因為在藥企的生產(chǎn)車(chē)間污染的菌很多和臨床是不一樣的，我們藥企應至少偏向于工業(yè)微生物的菌庫，如果不清楚如何區分，還有個(gè)簡(jiǎn)單的也是在購買(mǎi)前必須要做的試機過(guò)程，就是將自己環(huán)境菌庫中的已知微生物讓他們上機進(jìn)行鑒定，特別是有些生長(cháng)緩慢或當初鑒定時(shí)就比較難鑒定的菌株，如一些非發(fā)酵菌、棒狀桿菌等，比較鑒定結果。同時(shí)有些設備的菌庫會(huì )定期進(jìn)行更新，應提前詢(xún)問(wèn)好供應商菌庫更新的附加成本是多少，以便于及時(shí)補充菌庫量。
檢驗的復雜性、時(shí)間、一次檢驗量及其成本是設備日常使用過(guò)程中的重要參考項。如檢驗的復雜性是指人員手工需要處理樣本及上樣的時(shí)間，人工參與的時(shí)間越多結果的不可控性就越高，全自動(dòng)設備的好處即在于減少人為操作的步驟和時(shí)間，當然對于一些使用生化鑒定原理的設備，如有的4-8小時(shí)即出結果，但有些非發(fā)酵菌生長(cháng)緩慢，可能就會(huì )影響其鑒定結果。
購買(mǎi)鑒定設備細節較多，還是要根據各自企業(yè)的現狀進(jìn)行篩選并在URS上寫(xiě)清，若無(wú)預算也可使用API手工試條進(jìn)行鑒定。
三、其他設備
藥典升級后一些常用設備需要增加，特別是培養箱等，本次很多培養溫度均進(jìn)行了調整，需要考慮培養箱確認及日常校準溫度點(diǎn)的調整，如微生物限度霉菌及酵母菌總數溫度、控制菌中大腸埃希菌使用溫度等。
還有就是生物安全柜的增加，如鑒定需要，還有就是中檢所的老師也推薦微生物限度使用生物安全柜，處于既保護檢品又保護人員的考量，這也是企業(yè)可以考慮的一點(diǎn)。
微生物的輔助設備這次也可以一并考慮，如自動(dòng)菌落計數器等可以幫助提高實(shí)驗效率的儀器。
本次藥典升級帶來(lái)的設備升級或新增對于微生物實(shí)驗室是一次不小的挑戰，但也是與國際藥典接軌的非常重要的一步，我們微生物實(shí)驗室也不應滿(mǎn)足現有的傳統試驗方法，應多了解和接觸一些前沿設備，如微生物快速檢驗設備等，將微生物的檢驗技術(shù)不斷推進(jìn)。
