乳酸發(fā)酵與乳酸菌飲料

 一、實(shí)驗目的和內容
目的：學(xué)習乳酸發(fā)酵和制作乳酸菌飲料的方法，了解乳酸菌的生長(cháng)特性。
內容：1．從新鮮酸乳中進(jìn)行乳酸菌的分離純化。
2．乳酸發(fā)酵及檢測。
3．乳酸菌飲料制作。
4．自制乳酸質(zhì)量品嘗。
二、實(shí)驗材料和用具
嗜熱乳酸鏈球菌(Streptococcus thermophilus)、保加利亞乳酸桿菌(Lactobacillus bulgaricus)，乳酸菌種也可以從市場(chǎng)銷(xiāo)售的各種新鮮酸乳或酸乳飲料中分離；
BCG牛乳培養基、乳酸菌培養基、脫脂乳試管(見(jiàn)注)、脫脂乳粉或全脂乳粉、鮮牛奶、蔗糖、碳酸鈣；
恒溫水溶鍋、酸度計、高壓蒸汽滅菌鍋、超凈工作臺、培養箱、酸乳瓶(200～280mL,)、培養皿、試管、300mL三角瓶。
三、操作步聚
(一)乳酸菌的分離純化
1．分離   取市售新鮮酸乳或泡制酸菜的酸液稀釋至10-5，，取其中的10-4、10-52個(gè)稀釋度的稀釋液各0.1～0.2mL，分別接入BCG 牛乳培養基瓊脂平板上，用無(wú)菌涂布器依次涂布；或者直接用接種環(huán)蘸取原液平板劃線(xiàn)分離，置40℃培養48h，如出現圓形稍扁平的黃色菌落及其周?chē)�培養基變?yōu)辄S色者初步定為乳酸菌。
2．鑒別   選取乳酸菌典型菌落轉至脫脂乳試管中，40℃培養8～24h若牛乳出現凝固，無(wú)氣泡，呈酸性，涂片鏡檢細胞桿狀或鏈球狀(兩種形狀的菌種均分別選入)，革蘭氏染色呈陽(yáng)性，則可將其連續傳代4～6次，最終選擇出在3～6h能凝固的牛乳管，作菌種待用。
(二)乳酸發(fā)酵及檢測
1．發(fā)酵   在無(wú)菌操作下將分離的1株乳酸菌接種于裝有300mL  乳酸菌培養液的500mL三角瓶中，40～42℃靜止培養。
2．檢測   為了便于測定乳酸發(fā)酵情況，實(shí)驗分2組。一組在接種培養后，每6～8h取樣分析，測定pH值。另一組在接種培養24h后每瓶加入CaCO3 3g(以防止發(fā)酵液過(guò)酸使菌種死亡)，每6～8h取樣，測定乳酸含量(方法見(jiàn)注)，記錄測定結果。
(三)乳酸菌飲料的制作
1．將脫脂乳和水以1:7～10(WW)的比例，同時(shí)加入5%--6%蔗糖，充分混合，于80～85℃滅菌10～5min，然后冷卻至35～40℃，作為制作飲料的培養基質(zhì)。
2．將純種嗜熱乳酸鏈球菌、保加利亞乳酸桿菌及兩種菌的等量混合菌液作為發(fā)酵劑，均以2%～5%的接種量分別接入以上培養基質(zhì)中即為飲料發(fā)酵液，亦可以市售鮮酸乳為發(fā)酵劑。接種后搖勻，分裝到已滅菌的酸乳瓶中，每一種菌的飲料發(fā)酵液重復分裝3～5瓶，隨后將瓶蓋擰緊密封。
3． 把接種后的酸乳瓶置于40--42℃恒溫箱中培養3～4h。培養時(shí)注意觀(guān)察，在出現凝乳后停止培養。然后轉入4～5℃的低溫下冷藏24h以上。經(jīng)此后熟階段，達到酸乳酸度適中(pH4～4.5)，凝塊均勻致密，無(wú)乳清析出，無(wú)氣泡，獲得較好的口感和特有風(fēng)味。
4．以品嘗為標準評定酸乳質(zhì)量 采用乳酸球菌和乳酸桿菌等量混合發(fā)酵的酸乳與單菌株發(fā)酵的酸乳相比較，前者的香味和口感更佳。品嘗時(shí)若出現異味，表明酸乳污染了雜菌。比較項目按表22-1。
四、注意事項
1. 采用BCG牛乳培養基瓊脂平板篩選乳酸菌時(shí)，注意挑取典型特征的黃色菌落，結合鏡檢觀(guān)察，有利高效分離篩選乳酸菌。
2．制作乳酸菌飲料，應選用優(yōu)良的乳酸菌，采用乳酸球菌與乳酸桿菌等量混合發(fā)酵，使其具有獨特風(fēng)味和良好口感。
3．牛乳的消毒應掌握適宜溫度和時(shí)間，防止長(cháng)時(shí)間采用過(guò)高溫度消毒而破壞酸乳風(fēng)味。
4．作為衛生合格標準還應按衛生部規定進(jìn)行檢測，如大腸菌群檢測等。經(jīng)品嘗和檢驗，合格的酸乳應在4℃條件下冷藏，可保存6～7d。
五、實(shí)驗報告
1．乳酸發(fā)酵過(guò)程、檢測結果及結果分析。
表22—1  乳酸菌單菌及混合菌發(fā)酵的酸乳品評結果
2．將發(fā)酵的酸乳品評結果記錄于表22—1中；
六、問(wèn)題和思考
1、發(fā)酵酸乳為什么能引起凝乳？
2．為什么采用乳酸菌混合發(fā)酵的酸乳比單菌發(fā)酵的酸乳口感和風(fēng)味更佳？
3．試設計一個(gè)從市售鮮酸乳中分離純化乳酸菌的制作乳酸菌飲料的程序。
注：
（一）脫脂乳試管
直接選用脫脂乳液或按脫脂乳粉與5%蔗糖水為1：10的比例配制，裝量以試管的1/3為宜，115℃滅菌15min .
（二）乳酸檢測方法
1．定性測定  取酸乳上清液的10mL于試管中，加入10% H2SO4 1mL，再加2% KMnO4 1mL，此時(shí)乳酸轉化為乙醛，把事先在含氨的硝酸溶液中浸泡的濾紙條搭在試管口上，微火加熱試管至沸，若濾紙變黑，則說(shuō)明有乳酸存在，這里因為加熱使乙醛揮發(fā)的結果。
2．定量測定:
(1)測定方法:取稀釋10倍的酸乳上清液0.2mL，加至3mL pH9.0的緩沖液中，再加入0.2mL NAD溶液，混勻后測定OD340nm值為A1，然后加入0.02mL L(+)LDH，0.02 D(一)LDH，25℃保溫lh后測定OD340nm值為A2。同時(shí)用蒸餾水代替酸乳上清液作對照，測定步驟及條件完全相同，測出的相應值為Bl和B2。
（3）測定乳酸試劑的配制(見(jiàn)附錄)
3．酸乳的檢查指標  ①感觀(guān)指標：酸乳凝塊均勻細膩，色澤均勻無(wú)氣泡，有乳酸特有的悅味；②合格的理化指標：如脂肪≥3%，乳總干物質(zhì)≥11.5%，蔗糖≥5.00%，酸度70～110Tº，Hg﹤0.01×10-6mg/mL等；③無(wú)致病菌，大腸菌群≤40個(gè)/100m L。
     
   

 

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