非培養檢測技術(shù)在曲霉菌感染中的臨床應用進(jìn)展
錄入時(shí)間:2015-6-17 11:25:42
來(lái)源：青島海博生物
曲霉在環(huán)境中廣泛存在，主要通過(guò)呼吸道吸入霉菌胞子進(jìn)入人體。首先侵人感染肺部進(jìn)而發(fā)肺曲霉菌病。在血液系統疾病、肺結核、慢性支氣管炎、支氣管擴張、肺癌等免疫抑制患者中曲霉已成為僅次于白念珠菌的重要致病真菌。曲霉菌感染已成為最常見(jiàn)的、傳播最廣的條件致病霉菌之一，但早期診斷困難，常常導致治療時(shí)機延誤，病死率高達30％一50％ 。
傳統的真菌分離、培養和組織病理鑒定等診斷方法敏感性低、陽(yáng)性率低。早期、快速、簡(jiǎn)便、敏感、特異的診斷方法是目前條件性曲霉菌感染實(shí)驗診斷研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。近年來(lái)，國內外相繼建立了一系列非培養的檢測技術(shù)，現綜述如下：
一、特異性抗原的檢測
1 半乳甘露聚糖(Galactomannan，GM>是存在于曲霉和青霉細胞壁中的一類(lèi)具有高度特異性和高度保守性的多糖，可作為曲霉菌檢測的特異性分子的標志物�；净瘜W(xué)結構為B一(1，4)．苷鏈連接成的D一吡喃甘露糖為主鏈，以(It一(1，6)-苷鏈連接成的D-吡喃半乳糖構成為支鏈。每個(gè)GM上有十幾個(gè)這樣的半乳糖表位可被抗GM的單克隆抗體EB—A：識別。當曲霉菌吸入進(jìn)入人體肺組織中吞噬細胞便快速將它吞噬，消化處理后釋放出真菌細胞壁結構成分。通過(guò)血清、支氣管肺泡灌洗液、尿液、腦脊液均可監測到半乳甘露聚糖。其檢測方法有酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、放射免疫分析(RIA)和乳膠凝集試驗(LA)等，最低檢測限度為5—10 pg／mL。其中LA和ELISA 已經(jīng)商品化應用較廣泛。Kauffmann—Lacroix等 比較LA、ELISA、直接鏡檢和組織活檢各方法在診斷真菌性鼻竇炎的敏感度、特異度、陽(yáng)性預測值、陰性預測值，發(fā)現直接鏡檢法檢測敏感性低，影響臨床及時(shí)的診斷與治療，組織活檢敏感性高，但臨床很難廣泛開(kāi)展。Acosta 報道GM陽(yáng)性結果較曲霉菌培養早4．3天。2003年美國FDAGM檢測批準血GM監測用于血液、腫瘤等免疫低下者侵襲性曲霉感染的診斷指標 J。對高�；颊呙恐�2次連續動(dòng)態(tài)監測具有早期診斷價(jià)值。臨床常用試劑為美國platelia Aspergillus(Bio—Rad)GM ELISA，用ELISA(EB一2單抗，雙夾心法)的方法檢測GM(EBA一2單抗)。國內外研究多采用同樣的試劑和方法，但報道的判定界值尚不統一，主要原因是待檢人群不同，實(shí)驗條件限制以及采樣頻率等有關(guān) 。Fujiuchi S 在2001—2008年研究了1511肺部慢性疾病包括肺結核、COPD、肺間質(zhì)纖維化等肺部慢性疾病患者，當GM>0．5時(shí)，敏感性63．4％ ，特異性68．6％ ；當GM>0．51時(shí)，特異性更高；美國FDA判定血
GM>0．5為陽(yáng)性，歐盟判定I>0．51為陽(yáng)性。目前歐美專(zhuān)家一致認為兩次，GM>0．5可判定陽(yáng)性 J。除了血液標本支氣管肺泡灌洗液檢測GM是研究熱點(diǎn)，Park SY 報道了肺泡灌洗液GM包括359例患者，當BAL—GM≥0．5時(shí)其敏感性達64％ ，特異性89％ 。國外He H等 提出血聯(lián)合BALF檢測GM可提高IPA早期的診斷率，需要進(jìn)一步研究證明。
GM檢測對診斷曲霉菌感染有臨床意義，但少數情況下它可出現假陽(yáng)性、假陰性。假陽(yáng)性與進(jìn)食牛奶、應用青霉素如哌拉西林／他唑巴坦等有關(guān)。新生隱球菌的莢膜含有與GM呈交叉反應的表位，可出現假陽(yáng)性。另外棘白菌素類(lèi)抗真菌藥物的作用靶點(diǎn)為破壞真菌的細胞壁，因此在使用該類(lèi)藥物后同樣出現假陽(yáng)性。假陰性與抗真菌治療、病灶局部被纖維組織包裹未侵入血、組織液或與血液中的多種物質(zhì)結合后使其抗原表位被封閉、體內產(chǎn)生高滴度GM抗體有關(guān)。
2 1，3一B．D葡聚糖抗原(G試驗) 除結合菌和隱球菌除外的所有真菌的一種特異性的細胞壁成分，監測標本為血清，其敏感性和特異性均達到80％ 。此項檢測被美國FDA和歐洲許多國家批準用于血液、腫瘤等免疫受損者中。因對定植的念珠菌顯示陰性 l 常與GM聯(lián)合監測進(jìn)而提高曲霉菌感染診斷的敏感性，BG和GM均陰性基本可排除真菌感染。但血清學(xué)BDG檢測容易受到血液學(xué)及其他因素影響如纖維素類(lèi)物質(zhì)：手術(shù)中使用的紗布、海棉、血液透析中的纖維素膜、靜脈應用免疫球蛋白和白蛋白等。而且其在血液中可與抗體形成免疫復合物，并迅速被血液清除，造成假陰性 。
二、特異性抗體的檢測
侵襲性真菌病多為免疫受損宿主，常常缺乏可檢測到的抗體，或者抗體的產(chǎn)生變化較大。國外報道利用從真菌提取的天然抗原建立了多種地方性真菌病血清學(xué)檢測，包括芽生菌病、球抱子菌病、組織胞漿菌病、副球胞子菌病和毒霉病的早期診斷及流行病學(xué)調查，并顯示出較高的敏感性和特異性，在某些地方性條件性真菌感染顯示出一定的應用價(jià)值 。國內外研究曲霉菌特異性抗體均較少，敏感性和特異性較差，早期診斷價(jià)值不大。
三、特異性核酸的檢測
通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)特別是PCR擴增可在短時(shí)間內檢測微量的真菌DNA。臨床標本可選擇血液、尿液、BAL、腦脊液及玻璃體液，等。國外Raad等” 用PCR檢測了249例癌癥患者的BAL中曲霉的線(xiàn)粒體和堿性磷酸酶基因，敏感性、特異性及陽(yáng)性、陰性預期值分別為80％ 、93％ 、38％和99％ 。Sanguinetti 采用實(shí)時(shí)定量PCR法對4J4例IPA患者BAL中幾種睦霉菌(煙曲霉、黃曲霉、灰綠曲霉、黑曲霉和土曲霉)共有的18sRNA編碼基因上一個(gè)124bP的保守片段進(jìn)行檢測敏感性90％ ，特異性100％ 。Real—timePCR可以在封閉狀態(tài)對擴增產(chǎn)物進(jìn)行檢測，可避免擴增產(chǎn)物污染而引起的假陽(yáng)性結果。同時(shí)還可以結合限制性?xún)惹忻竵?lái)分析區別鑒定致病菌的種屬。因此隨著(zhù)實(shí)時(shí)PCR技術(shù)的完善和發(fā)展，通過(guò)監測曲霉的DNA水平實(shí)施療效監控提示預后，將大大提高PCR用于臨床系統性真菌感染早期診斷的價(jià)值。
四、特異性代謝物的檢測
檢測真菌感染代謝物D一甘露聚醇(mannito1)可用于曲霉菌感染的診斷。國外動(dòng)物實(shí)驗研究報道曲霉菌D一甘露醇水平明顯高于非感染對照組 J。而國內相關(guān)報道尚未見(jiàn)明確報道。由于不同菌株產(chǎn)生代謝物能力差別較大，而且受體內代謝物及其他微生物代謝物的干擾，檢測所需的儀器設備要求較高，目前仍處于科研階段，臨床常規應用受到限制，因此需要更大量的實(shí)驗進(jìn)一步證實(shí)。
五、免疫組化
免疫組織化學(xué)是用標記的抗體或抗原對細胞或組織中的相應抗原或抗體進(jìn)行定性、定位或定量檢測，經(jīng)過(guò)組織化學(xué)的顯色反應舌，顯微鏡進(jìn)行觀(guān)察，具有特異性、敏感性高的優(yōu)點(diǎn)，并可將形態(tài)學(xué)和功能代謝密切結合。國外已有制備出鼠抗煙曲霉單克隆抗體，兔抗新型隱球菌及兔抗白念珠氫多克隆抗體。該方法國內外研究尚處于動(dòng)物試驗階段，臨床應用未見(jiàn)相關(guān)報道。
非培養的曲霉菌檢測技術(shù)具有快速、簡(jiǎn)便，敏感性、特異性高的優(yōu)點(diǎn)，在診斷曲霉菌感染有重要的價(jià)值，為臨床早期快速診斷侵襲性曲霉菌感染帶來(lái)了希望，對及時(shí)控制病情、疾病
的預后具有重要意義。隨著(zhù)對真菌基因分析和成分的深入研究，以及新的更先進(jìn)檢測技術(shù)的問(wèn)世，非培養的快速檢測技術(shù)，將成為曲霉菌感染實(shí)驗室診斷的重要手段。
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