細菌的鏡檢

細菌的鏡檢的項目有細菌的形態(tài)、大小、革蘭氏染色反應，有無(wú)芽孢、莢膜、鞭毛以及細胞運動(dòng)情況等。

1、細菌的制片方法：在鏡檢前必須將被檢物制成玻片標本，才能觀(guān)察，用于標本的玻片應非常干凈。

根據被檢物所要檢查的項目和供檢材料的不同，其制片方法有以下三種：

①普通法（壓片法）：用普通法制作活細菌標本，不但便于觀(guān)察細菌的運動(dòng)，而且還能觀(guān)察細菌的形狀、大小和芽孢。其方法是：在干凈的載玻片上滴一滴蒸餾水，用接種環(huán)挑取一環(huán)供檢材料放入水中并混勻，若供檢材料為液體而不太濃時(shí)，則不必加水。然后加放蓋玻片，在蓋片時(shí)，應先把蓋片的一端放在載玻片上，再慢慢向下壓蓋，勿使水從該玻片邊緣溢出。同時(shí)避免發(fā)生氣泡，然后用干凈的玻璃棒等使蓋片緊貼在載玻片上。

為了便于觀(guān)察，可用美藍或復紅等染色液代替誰(shuí)使用，將細菌染成藍色或紅色，然后把蓋玻片蓋上，在進(jìn)行鏡檢，這樣看的較為清晰。

②懸滴法：懸滴法用于觀(guān)察生活狀態(tài)的細菌，如細菌的運動(dòng)、繁殖方式、孢子萌發(fā)等。其方法是：取一滴蒸餾水或培養液于干凈的蓋玻片中央，再取一環(huán)培養好的菌體，接種于蓋玻片的液滴中，然后將蓋玻片翻轉過(guò)來(lái)，蓋于凹玻片的凹窩中，使菌液正好倒垂在載玻片的凹窩中央，不要使水滴碰到凹窩的壁和底。為防止干燥，在蓋玻片邊沿上涂上凡士林，使菌液緊緊處在密閉的小室中，即可鏡檢。因為沒(méi)有染色的活細菌是透明的，不易看到，必須降低聚光器或縮小光圈，以減少照明強度，認真觀(guān)察，才能得到良好效果，若觀(guān)察其繁殖或孢子萌發(fā)時(shí)，需將帶有懸滴的玻片放在底部鋪有濕紙或濕棉的培養皿中，以便保濕，蓋好皿蓋進(jìn)行定溫培養，而后鏡檢。

③涂片法：涂片法適用于細菌結構的觀(guān)察，其方法是：首先在干凈的載玻片中央加一滴蒸餾水，用滅菌的接種環(huán)取少許菌體，放在載玻片上，與水混合涂成直徑約為1cm的均勻薄片，即成涂片。用這種涂片法制的標本在顯微鏡下一般不直接看，經(jīng)染色后才能看得清晰。

2、細菌的染色方法：由于細菌個(gè)體透明，在光學(xué)顯微鏡下不易觀(guān)察到其形態(tài)，必須借助于染色的方法使菌體著(zhù)色，增加與背景的明暗對比，才能在光學(xué)顯微鏡下較為清楚地觀(guān)察其個(gè)體形態(tài)和部分結構。

按照所用染料種類(lèi)的不同，可將染色法分成兩大類(lèi)：?jiǎn)稳旧�法和復染色法�?/span>

單染色法又稱(chēng)普通染色法，只用一種染料染色，適用于菌體一般形態(tài)觀(guān)察。操作過(guò)程為：按涂片法制成的涂片，進(jìn)行固定，固定方法有自然干燥或加溫干燥。通常采用加溫固定，可在酒精燈火焰上快速來(lái)回烘烤涂片背面，以手摸載片發(fā)燙時(shí)為宜。在固定好的玻片上加染色液1~2滴（呂氏美藍或堿性復紅液），使其蓋滿(mǎn)玻片，靜止1~2min。用細小水流慢慢沖去染料，再用吸水紙吸去玻片上的水分，待晾干后即可鏡檢。

復染色法（革蘭氏染色法）又稱(chēng)鑒別染色法，是用兩種或多種染料進(jìn)行染色，有幫助鑒別細菌之用。最常用的為革蘭氏染色法。染色結果，菌體呈紫色的為革蘭氏陽(yáng)性菌（G+），紅色者為革蘭氏陰性菌（G-）

其操作步驟如下：

①涂片固定：取培養24~48h的細菌按單染色法涂片固定。

②初染：滴加結晶紫液，全部覆蓋于涂片上，染色1min后，用細水流沖洗，而后用吸水紙輕輕吸干。

③媒染：加路氏碘液，1min后水洗，同樣用吸水紙吸干。路氏碘液是一種媒染劑，具有助染作用。

④脫色：加95%（體積分數）酒精經(jīng)10~30秒后，水洗，同樣用吸水紙吸干。

⑤復染：加石炭酸復紅液染0.5min后，水洗，吸干。即可在油鏡下鏡檢。

在進(jìn)行革蘭氏染色過(guò)程中，以涂片和酒精脫色這兩步最為關(guān)鍵。涂片切不可過(guò)于濃厚，要求薄而均勻。過(guò)于密集的細菌涂片常常影響脫色結果，而呈現假陽(yáng)性反應。95%（體積分數）酒精，這種脫色劑，脫色能力很強，所以要求脫色時(shí)應恰當掌握。脫色過(guò)輕，陰性菌脫色不掉紫色會(huì )造成假陽(yáng)性；若脫色過(guò)重，陽(yáng)性菌的紫色也會(huì )被脫掉而造成假陰性。

此外，革蘭氏染色的結果還與菌齡有關(guān)。一般幼齡菌的革蘭氏染色反應比較正常，老齡菌的革蘭氏染色反應常有變化，特別是革蘭氏陽(yáng)性菌，在老齡時(shí)常是陰性反應。因此，革蘭氏染色所用的菌種一般是24~48h的培養物。

3、細菌芽孢、莢膜、鞭毛染色法：細菌芽孢染色法：芽孢染色法是利用細菌和菌體對染料的親和力不同的原理，用不同染料進(jìn)行著(zhù)色，使芽孢和菌體呈不同的顏色而便于區別，芽孢壁厚、透性低，著(zhù)色、脫色均較困難。因此，當先用一弱堿性染料，如孔雀綠或堿性品紅，在加熱條件下進(jìn)行染色時(shí)，此染料不僅可以進(jìn)入菌體，而且也可以進(jìn)入芽孢。進(jìn)入菌體的染料可經(jīng)水洗脫色，而進(jìn)入芽孢的染料則難以透出。若再用復染液（如番紅液）或襯托液（如黑色素）處理，則菌體和芽孢易于區分。其操作過(guò)程如下：

①將培養24h左右的芽孢桿菌作涂片、干燥、固定。

②滴加3~5滴孔雀綠染色液于已固定的涂片上。

③用木夾夾住載玻片在火焰上加熱，使染液冒蒸汽，但勿沸騰。切忌時(shí)染液蒸干，必要時(shí)可添加少許染液。加熱時(shí)間從染液冒蒸汽開(kāi)始約4~5min。

④傾去染液，待玻片冷卻后水洗至孔雀綠不再褪色為止。

⑤用番紅水溶液復染1min，水洗。

⑥待干燥后，置油鏡觀(guān)察，芽孢呈綠色，菌呈紅色。

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