微生物挑戰試驗

第6章  微生物挑戰實(shí)驗

1. 簡(jiǎn)介

微生物挑戰實(shí)驗已經(jīng)并將繼續是確定食品是否支持腐敗微生物或病原體生長(cháng)能力的一個(gè)有用工具。微生物挑戰實(shí)驗還是針對靶生物或一組靶生物具有殺傷力過(guò)程能力驗證的重要手段。通常，實(shí)驗后的目的是必然發(fā)布一個(gè)有關(guān)殺傷力過(guò)程的性能指標（例如：對發(fā)酵肉制品中大腸桿菌O157：H7減少5個(gè)對數值）。設計適當的微生物挑戰實(shí)驗將驗證具體過(guò)程是符合預定的性能指標。微生物挑戰研究的設計、實(shí)施和評估是一個(gè)復雜的任務(wù)，取決于相關(guān)的產(chǎn)品是如何開(kāi)發(fā)、制造、包裝、交付、制備和消費等因素。微生物學(xué)家必須考慮前述的相關(guān)因素，并設計一項食品安全評估最佳的方案。未能考慮特定的產(chǎn)品和環(huán)境因素的實(shí)驗方案，會(huì )導致有缺陷的結論。

微生物挑戰實(shí)驗對確定一些冷藏或室溫保存的食品潛在貨架壽命是有用的。確定挑戰實(shí)驗是否適當或有用必須考慮的因素：如產(chǎn)品支持腐敗微生物或病原體生長(cháng)的可能性，或之前對產(chǎn)品的認知。例如：對冷凍食品進(jìn)行挑戰實(shí)驗是沒(méi)有意義的，因為其在合適的儲存條件下不支持微生物生長(cháng)；而對于罐頭食品進(jìn)行挑戰實(shí)驗來(lái)反推商業(yè)無(wú)菌是特別有用的。但是，以罐頭食品為例，它或許適于作為過(guò)程驗證的部分方案來(lái)進(jìn)行接種組的研究。對于支持病原微生物生長(cháng)的食品，在冷藏、溫度回升或處于環(huán)境溫度下時(shí)，則易于受到微生物生長(cháng)的危害，進(jìn)行微生物挑戰實(shí)驗是非常有用的。

在進(jìn)行微生物挑戰實(shí)驗時(shí)，許多因素必須考慮(Vestergaard 2001)。這包括：1）適當的病原體或替代物的選擇， 2）挑戰接種的水平，3）接種物制備和接種的方法，4）實(shí)驗的持續時(shí)間，5）配方的因素和儲存條件， 6）樣品分析。數據的解析和合格/不合格的標準是評估食品安全是否需要控制時(shí)間/溫度的關(guān)鍵。

而微生物挑戰實(shí)驗對確定產(chǎn)品配方是否能抑制產(chǎn)品潛在腐敗是有用的，本章其余部分的討論將側重于對相關(guān)的食品病原體通過(guò)控制時(shí)間/溫度以保障食品安全。

2. 挑戰實(shí)驗用微生物的選擇

表6-1列出了用于各種類(lèi)型食品挑戰實(shí)驗用的一些病原體(Vestergaard 2001)。食品配方知識和食品的歷史（例如：聯(lián)想到已知的疾病暴發(fā)和/或潛在的增生證據）對選擇適當的挑戰病原體時(shí)是必不可少的。例如：某些氣調包裝（MAP）的產(chǎn)品要關(guān)注肉毒梭菌，在低AW的產(chǎn)品很少有競爭力的微生物，就需要關(guān)注金黃色葡萄球菌。

理想的挑戰實(shí)驗用微生物的是那些先前已經(jīng)從類(lèi)似配方食品中分離出來(lái)的。此外，還應包括已知的食源性疾病暴發(fā)的病原體，以確保配方健全到足以抑制這些微生物為宜。

挑戰實(shí)驗應包括目標致病菌多個(gè)特定的菌株。為了說(shuō)明潛在的菌株變化，用“雞尾酒”或多種菌株的混合物挑戰食品配方是一種典型實(shí)驗。在一個(gè)挑戰實(shí)驗中目標致病菌用5個(gè)或更多的菌株是不尋常的。例如：肉毒桿菌挑戰實(shí)驗通常包括幾種菌株為蛋白水解A和B型，以及代表非蛋白水解菌株（如果適用）。具有明確良好特征的單菌株用于篩選產(chǎn)品配方挑戰實(shí)驗與過(guò)去那些已被自然廣泛運用多菌株挑戰實(shí)驗相似。

在此之前進(jìn)行的挑戰實(shí)驗，相互對立的菌株應進(jìn)行篩選確定。李斯特菌的某些菌株之間的拮抗作用已有報道，肉毒梭菌的某些菌株與產(chǎn)細菌素的乳酸菌之間也一樣有拮抗作用。如果這些不兼容是一個(gè)“雞尾酒”挑戰實(shí)驗的一部分時(shí)，那么錯誤的結果可能會(huì )接踵而至。

同樣重要的是在標準的條件與規范下培育和制備挑戰懸浮液。用于增殖挑戰微生物的培養溫度和產(chǎn)品儲存溫度的改變已經(jīng)顯示出改變挑戰實(shí)驗自身（1991 Curiale）的滯后期長(cháng)度。在接種前必須考慮到挑戰用懸浮液要適用食品配方的環(huán)境。例如：當接種到酸性食品，在接種前大腸桿菌O157：H7細胞或沙門(mén)氏菌細胞耐酸性如何會(huì )極大地影響它們的生存能力。

最后，使用基因特征工具（如有的話(huà)）非常有助于菌株在挑戰實(shí)驗中的判定，這在縮短實(shí)驗時(shí)間方面是有顯著(zhù)優(yōu)勢的。這類(lèi)工具如：基因指紋和脈沖場(chǎng)凝膠電泳可以幫助鑒別無(wú)論是接種的或天然存在的菌株(Farber等人2001)。挑戰用微生物也可被遺傳修飾以攜帶標記物有助于從其它菌株區分開(kāi)來(lái)，并有利于在食品中檢測到它們。顯然，遺傳修飾生物體需要具有與野生型或親本菌株可比的生理特性。

對于某些應用，替代微生物可用于挑戰使用代替特定病原體。例如：它通常是不可能引入病原體進(jìn)入的加工廠(chǎng)；因此，在這些情況下理想的方式是使用替代的微生物。一個(gè)理想的替代是靶病原體菌株，其保存所有其他特征，除了它的毒力外。然而在實(shí)踐中，許多替代物是密切相關(guān)的，但不一定是相同種類(lèi)的靶病原體。傳統的例子包括使用生孢梭菌的作為肉毒桿菌的接種組研究的替代，無(wú)害李斯特菌作為單增李斯特菌的替代，大腸桿菌的通用菌株作為大腸桿菌O157：H7的替代。在其后使用中，由于大腸桿菌的通用菌株不具有大腸桿菌O157：H7相同的耐酸性水平，這點(diǎn)必須引起注意。因此，在一個(gè)挑戰實(shí)驗中雖然使用大腸桿菌的通用菌株可能是適合以評估高pH值食品的加熱過(guò)程或防腐體系產(chǎn)生的影響，但用于評估酸性食品使用這些通用菌株是不恰當的。通常，替代從一組良好表征的生物中選擇并具有以下所需屬性（IFT 2000）：

•非致病性。

•滅活特性和動(dòng)力學(xué)可用于預測那些靶病原體。

•暴露在配方和/或加工參數（例如：pH穩定性、溫度敏感性、和氧耐受性）的行為類(lèi)似于目標病原體。

•穩定和持續增生的特征。

•易于制備成高濃度的菌液。

•一旦制備，菌數量保持穩定直到使用。

•輕松找出可采用的快速、靈敏和便宜的檢測系統。

•從背景菌群中能輕松區分。

•模仿那些目標病原體具有的特征。

•基因穩定，在獨立的實(shí)驗室或不同的實(shí)驗時(shí)間結果可被復制。

•如果用于生產(chǎn)區域不會(huì )滋生為一個(gè)“腐敗”的微生物群體。

•敏感性損傷類(lèi)似于目標病原體。

如果一個(gè)替代菌株用于微生物挑戰實(shí)驗，實(shí)驗之前應做的基礎工作是該菌株應具有良好的屬性。應確定屬性如以上討論的那些，并通過(guò)初步的實(shí)驗室工作證實(shí)以保證替代菌株是適合于預期的目的。僅當特定病原體因安全的原因絕對不能用于產(chǎn)品或人員時(shí)才使用替代。

3. 接種量

在微生物挑戰實(shí)驗中使用的接種量取決于研究的目的是否是確定產(chǎn)品的穩定性和保質(zhì)期或驗證在旨在減少微生物數量的加工步驟。通常情況下，產(chǎn)品中接種量在102 - 103個(gè)細胞/克之間，以用來(lái)確定配方的微生物穩定性。其它產(chǎn)品更高的接種量可能是適當的。根據產(chǎn)品的配方，一些接種的菌株在開(kāi)始適應環(huán)境的初期可能會(huì )死光。如果使用太低的接種量時(shí)，不正確的假設，會(huì )認為該產(chǎn)品是穩定的，事實(shí)它不是。相反，如果為此目的接種量過(guò)高，不恰當的接種量抹殺了防腐體系或抑制生長(cháng)的功效，從而導致不正確的結論：配方是不穩定的。當用于驗證殺菌工序如加熱處理、高壓處理或輻照，反而，通常有必要使用高的接種量（例如：106 - 107個(gè)細胞/克產(chǎn)品），以表明挑戰菌株減少的程度。例如：在美國果汁加工商現在需要證明有關(guān)危險的微生物在其產(chǎn)品中減少5個(gè)對數值（5D性能指標）。這些對數減少驗證方案通常需要使用平板法。在枚舉法的統計限內，為了測量減少到這一水平，接種量必須至少為10 6 CFU / g。

4. 接種準備和接種方法

在微生物挑戰實(shí)驗中使用菌種的制備是整體方案的一個(gè)重要組成部分。通常情況下，使用冷藏肉湯培養或斜面或冷凍甘油恢復后培養菌種18 - 24小時(shí)。挑戰用菌種應在培養基中能生長(cháng)，并處于適于其最佳的培養條件下。在一些實(shí)驗中，具體挑戰微生物適用于特定的條件。為適應特定的食品需要進(jìn)行調整。例如：在進(jìn)行酸性食品的挑戰實(shí)驗前，大腸桿菌O157：H7可以使用適當的酸化劑進(jìn)行酸適用。細菌孢子懸浮液可被存儲在冷藏水或冷凍甘油中。接種前將孢子懸浮液用無(wú)菌水稀釋并立即熱休克。肉毒梭菌孢子使用前應徹底清洗，以確保沒(méi)有肉毒桿菌毒素被帶入進(jìn)行挑戰實(shí)驗的產(chǎn)品中，并且，如果可能的話(huà)，孢子應在食物中熱休克以進(jìn)行研究。挑戰混懸液定量計數，通過(guò)挑戰產(chǎn)品中目標接種物的稀釋來(lái)計算。當使用某些病原體進(jìn)行挑戰實(shí)驗時(shí)，應采用適當的程序和防護設施。

在進(jìn)行微生物挑戰實(shí)驗時(shí)接種的方法是另一個(gè)非常重要的考慮因素。經(jīng)受挑戰時(shí)必須盡一切努力不改變產(chǎn)品配方的關(guān)鍵參數。有各種接種方法，可以根據受到挑戰的產(chǎn)品類(lèi)型來(lái)采用。在含水的液體基質(zhì)如調味汁和鹵汁具有高aw（> 0.96），所面臨的挑戰接種物可被直接接種到產(chǎn)品中混合，用最小量的無(wú)菌水或緩沖液作為載體。在食品中添加使用稀釋液調整到產(chǎn)品的大致aw的保濕劑，以最大限度地減少影響食品aw 導致錯誤結果的可能性。在實(shí)驗中，其中的濕度水平是實(shí)驗變量之一，接種物懸浮在水中或液體中用于調節配方的水分含量。對于間歇式接種，所述的接種物可直接加入到混合缽或容器中的產(chǎn)品中。對于獨立包裝或袋式類(lèi)型應用，接種物可以使用無(wú)菌注射器通過(guò)無(wú)菌方式注入含有橡膠隔膜的包裝壁內。對于aw > 0.96的固體基質(zhì)，如煮過(guò)的面或肉表面，一個(gè)替代注射器的方法可以是使用一種霧化器。懸浮于無(wú)菌水或緩沖液中的接種物用噴霧器噴灑，將其噴到顆粒產(chǎn)品內或產(chǎn)品的表面。噴撒應在排氣罩下來(lái)完成，或使用其他保護裝置，以避免產(chǎn)生的致病菌導致人員的安全問(wèn)題。在所有這些應用，應使用最小量的水或緩沖液應用于懸浮接種物。接種物也可以使用一個(gè)絨墊、畫(huà)墊或類(lèi)似的纖維布按提供的方法來(lái)校準，并以最小的濕氣轉移再現接種物水平。應做基礎分析以確保配方的aw或水分含量接種后不改變。對aw <0.92的產(chǎn)品或組份可以用霧化器方法用最小體積的水或緩沖液來(lái)接種。產(chǎn)品應始終進(jìn)行檢查，再次強調以確保最終產(chǎn)品aw或水分含量沒(méi)有被改變。簡(jiǎn)要：一些產(chǎn)品在最終包裝前需要有一個(gè)接種后的干燥期。作為選擇，它們可以接種已懸浮于載體水或緩沖液中挑戰生物添加到無(wú)菌砂、面粉或粉末形式的產(chǎn)品（例如：干燥面食），并使其干燥。凍干培養物也可用于某些應用。接種的可行性和增殖水平應提前研究確定。將制備的干燥接種物無(wú)菌添加到測試產(chǎn)品，為均勻分布接種物應搖動(dòng)或徹底攪拌。

應接種足夠的產(chǎn)品保障每次采樣時(shí)至少重復三次，以獲得一個(gè)全面的挑戰實(shí)驗。在某些情況下，如在一些再驗證實(shí)驗和未接種的對照樣品，重復進(jìn)行的次數可以減少。

5. 實(shí)驗持續時(shí)間

保守的微生物挑戰實(shí)驗至少在產(chǎn)品期望的保質(zhì)期內進(jìn)行。更多期待的是，用一個(gè)完整的預期望保質(zhì)期加上超出預期保質(zhì)期的一個(gè)余量的產(chǎn)品進(jìn)行挑戰實(shí)驗；如果用戶(hù)將持有并消費超出其預期保質(zhì)期的產(chǎn)品，因為通過(guò)實(shí)驗確定其會(huì )發(fā)生什么，這點(diǎn)非常重要。一些管理機構要求至少在預期的保質(zhì)期數據上加上至少三分之一。

影響挑戰實(shí)驗持續時(shí)間的另一個(gè)考慮的因素是產(chǎn)品儲存的溫度。在目標的儲存溫度下冷藏產(chǎn)品其整個(gè)保質(zhì)期均可作挑戰實(shí)驗，但濫用溫度條件下，他們通常持有較短時(shí)間。

在某些食品服務(wù)場(chǎng)所，為方便而將特定冷藏要求食品保存在保質(zhì)期更短的室溫下。例如：一些快餐操作為方便制定一個(gè)8小時(shí)在室溫下存放干酪片的時(shí)間。當加工熱三明治時(shí)，這會(huì )使得奶酪會(huì )軟和融化得更快。然而，由于餐廳操作時(shí)的交叉污染，病原體可能存在于干酪片中；因此挑戰實(shí)驗將需要提供證據表明這種做法是安全的。如果餐廳一班次想保存干酪片在室溫下達8小時(shí)，挑戰實(shí)驗的持續時(shí)間至少應為12小時(shí)。如果通過(guò)餐廳操作造成干酪片交叉污染，進(jìn)行該挑戰實(shí)驗是為確認病原體的快速增殖不會(huì )發(fā)生。

因為可能在某些產(chǎn)品會(huì )發(fā)生接種病菌的亞致死，還希望產(chǎn)品的測試顯著(zhù)超出其整個(gè)保質(zhì)期。在此接種物可能無(wú)法培養，這會(huì )導致長(cháng)的滯后期；但隨著(zhù)時(shí)間的推移，少數損傷的細胞在產(chǎn)品中又恢復生長(cháng)。這種反彈或“鳳凰涅槃”現象，已經(jīng)在多項產(chǎn)品中觀(guān)察到(Jay 1996)。如果產(chǎn)品不是在至少整個(gè)保質(zhì)期內測試，有可能錯過(guò)在保質(zhì)期后挑戰生物體的復蘇和后續生長(cháng)。

測試的頻率由微生物挑戰實(shí)驗的持續時(shí)間所約束。為了接種操作有良好的代表性，理想情況在保質(zhì)期內至少有5-7個(gè)數據點(diǎn)。通常情況下，如果保質(zhì)期的單位是天，測試的頻率如果不是每天多次應至少是每天。如果保質(zhì)期的單位是幾個(gè)星期或幾個(gè)月，測試頻率一般不少于每周一次。實(shí)驗首次應該是“零時(shí)間”測試，即分析產(chǎn)品接種后就開(kāi)始測試。對于某些類(lèi)型的產(chǎn)品，它也可能希望允許有一個(gè)平衡期讓接種物適應測試前的產(chǎn)品。在挑戰實(shí)驗早期（即：在最初幾天或一周）可能需要更頻繁地測試（例如：每天或每天多次），然后以較長(cháng)的時(shí)間間隔降低測試的頻率。

6.配方因素和儲存條件

當評估配方時(shí)，了解控制微生物穩定性的關(guān)鍵參數的范圍是很重要的。內在因素，例如：pH、aw或防腐水平是防止病原體的生長(cháng)或防止腐敗的關(guān)鍵，將影響到預期保質(zhì)期內產(chǎn)品的安全性。因此，重要的是要在最壞的條件下測試配方中單獨和/或組合的每個(gè)關(guān)鍵變量。例如：如果目標pH值是4.8±0.2和在工序能力容許范圍內，在該范圍內高一端（即，pH值5.0）的挑戰產(chǎn)物是重要。同樣，如果山梨酸的用量為0.15±0.05％的水平，該挑戰產(chǎn)品應為0.10％的低濃度。這個(gè)建議，以確保挑戰實(shí)驗覆蓋了對配方中的每個(gè)關(guān)鍵因素過(guò)程能力的范圍。相關(guān)的固有性質(zhì)，如pH值、aw和滲透壓每次實(shí)驗應該記錄以供將來(lái)比較和參考。

試驗樣品最好應存儲在用于市場(chǎng)銷(xiāo)售的相同包裝內。如果商品是真空或MAP包裝，那么在微生物挑戰實(shí)驗中使用的樣品應使用相同的包裝袋在相同的條件下進(jìn)行包裝。

在微生物挑戰實(shí)驗中使用的儲存溫度應包括產(chǎn)品在儲存和銷(xiāo)售過(guò)程中典型的溫度范圍。一個(gè)冷藏產(chǎn)品，可能會(huì )處在一個(gè)差的溫度下，那么應在代表差的溫度條件下受到挑戰。產(chǎn)品可能會(huì )處于高濕度環(huán)境下，也應在此條件下挑戰（Notermans和他人，1993）。有些挑戰實(shí)驗可能將溫度循環(huán)包含到方案中。例如：制造商在產(chǎn)品部分保質(zhì)期內可以給產(chǎn)品在一個(gè)良好控制的冷藏條件下，在此之后，產(chǎn)品使用前和使用過(guò)程中可能隨即遭受到高溫。

7.樣品分析

在微生物挑戰實(shí)驗中，要列出在每個(gè)采樣點(diǎn)活的挑戰微生物典型水平。通常，在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)理想情況是至少應有一式兩份、最好一式三份的樣品進(jìn)行分析。在需要較高水平的確定性情況下，應使用一式更多份樣品或重復進(jìn)行實(shí)驗。選擇常見(jiàn)的培養基和培養方法（例如：直接平板接種MPN）依賴(lài)于在實(shí)驗中使用的病原體或替代微生物物的類(lèi)型。如果產(chǎn)品沒(méi)有大量的背景微生物，可使用非選擇性培養基直接用于增殖。在使用產(chǎn)毒素微生物情況下（例如：金黃色葡萄球菌或肉毒梭菌），使用大多數現行的驗證方法在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)應進(jìn)行適當的毒素測試�？赡懿⒉恍枰�在實(shí)驗的每個(gè)時(shí)間點(diǎn)都進(jìn)行毒素水平測試，但在整個(gè)產(chǎn)品預期的保質(zhì)期間要規劃較短的時(shí)間間隔來(lái)進(jìn)行較多次測試，以確定保質(zhì)期是否可以接受。在適當情況下，復蘇方法可避免產(chǎn)生錯誤的結果。

謹慎地分析產(chǎn)品，包括未接種的對照樣品，在每個(gè)或選定的采樣點(diǎn)來(lái)研究看背景菌群的行為對產(chǎn)品保質(zhì)期的影響。例如：如果一個(gè)產(chǎn)品具有較高的背景菌群，它可能抑制挑戰接種物的生長(cháng)。因為病原體增殖之前的產(chǎn)品變質(zhì)在一些情況下是有益的、期望的。在其他情況下，背景微生物可能并不普遍存在，會(huì )導致一個(gè)潛在的安全錯覺(jué)。此外，在某些情況下，隨著(zhù)時(shí)間的推移背景微生物可以改變產(chǎn)品中配方的參數有利于或抑制接種物的生長(cháng)（例如：霉菌可提高產(chǎn)物的pH；乳酸菌能夠降低產(chǎn)品的pH）。

同樣重要的是在保質(zhì)期跟蹤產(chǎn)品的相關(guān)的物理化學(xué)參數，看看它們是如何改變和影響病原體的行為。了解怎樣的因素如aw、水分、滲透壓、pH值、MAP氣體濃度、防腐劑水平和其他變量的行為對產(chǎn)品保質(zhì)期的影響是認知產(chǎn)品微生物穩定性的關(guān)鍵。

8.數據解讀

一旦微生物挑戰實(shí)驗完成后，應分析數據看病原體隨時(shí)間變化如何表現。數據的趨勢分析和適當的圖形繪制（即，半對數圖）將顯示隨著(zhù)時(shí)間的變化挑戰生物是否死亡、保持穩定或數量增加。對于產(chǎn)毒素的病原體，設定的挑戰期間應無(wú)毒素被檢測到。結合背景微生物及相關(guān)的理化數據與每個(gè)時(shí)間點(diǎn)定量接種數據，這樣在配方的微生物學(xué)穩定性評價(jià)上具有一個(gè)有力的證據和廣泛的代表性。根據這些數據以形成或調整產(chǎn)品配方，使得在合理的保質(zhì)期內病原體不易生長(cháng)。

當使用微生物挑戰實(shí)驗，作為一個(gè)過(guò)程驗證方案的一部分，數據的分析顯示過(guò)程是否能夠達到致死所需的水平（即，符合預先確定的能力標準）。為了滿(mǎn)足致死要求，如果必要的話(huà)可基于這些信息進(jìn)行過(guò)程調整。

微生物挑戰實(shí)驗的數據可以用于開(kāi)發(fā)微生物預測模型或驗證現有的過(guò)程。預測模型是基于計算機為基礎的方案來(lái)模擬或預測配方在特定條件下微生物將怎樣表現（例如：pH值、aw、水分、鹽和防腐劑）。微生物挑戰實(shí)驗既用來(lái)產(chǎn)生這些類(lèi)型的以實(shí)驗為依據的模型，也用于驗證其適用性。

總體而言，精心設計的挑戰實(shí)驗可以提供一種食品配方的微生物安全性和穩定性的關(guān)鍵信息。驗證一個(gè)過(guò)程關(guān)鍵殺菌能力或微生物控制點(diǎn)其也是非常有價(jià)值的。挑戰研究非常有助于確定食品是否需要在其整個(gè)保質(zhì)期進(jìn)行溫度控制，或者在其全部或部分保質(zhì)期內它是否可以保存在室溫下。

9.實(shí)驗通過(guò)/失敗的標準

選擇微生物用于挑戰實(shí)驗和/或挑戰模型取決于通過(guò)商業(yè)經(jīng)驗所獲得的知識和/或考慮食品的流行病學(xué)資料或由于病原體生長(cháng)導致類(lèi)似食品可能產(chǎn)生的危害。另外，產(chǎn)品固有屬性（例如：pH值、水活度、和防腐劑）和外在屬性（例如：氣體、溫度和工序）也應該加以考慮。每種微生物的危險特性隨著(zhù)顯著(zhù)的增殖而不同。例如：傳染性病原體的生長(cháng)應當保持控制，多數情況下只有經(jīng)過(guò)大量增殖才會(huì )產(chǎn)生毒素而導致危害。在適當控制的情況下，產(chǎn)毒微生物的生長(cháng)并不能導致健康危險，但將要產(chǎn)毒。

經(jīng)過(guò)小組的推薦、合理的選擇和增殖限評估后，下面所列微生物可用于微生物挑戰實(shí)驗。

為了安全，對于產(chǎn)毒霉菌如曲霉屬、青霉屬和鐮刀菌需要控制時(shí)間/溫度，因霉菌變質(zhì)的食品可以辨識以防止被食用，所以不推薦用于挑戰研究。 

蠟樣芽胞桿菌：不能形成毒素是選擇它的關(guān)鍵。由于毒素測量是困難的，因此需要控制時(shí)間/溫度以達成接種水平3個(gè)對數值內的增殖。這種增殖極限確定是基于以下情況：

•  蠟樣芽孢桿菌的典型初始水平較低；因此，基于文獻中1000CFU/g是一個(gè)保守的初始水平。

•  菌群數達到>106 CFU/g的水平，會(huì )產(chǎn)生危害健康的毒素（2001年FDA）。

•  蠟樣芽孢桿菌的致吐毒素具有熱穩定性；因此，消減是不可能的。

其他注意事項：

•  蠟狀芽孢桿菌孢子對熱都相對敏感。用于面包產(chǎn)品烘焙可能會(huì )殺滅其在面粉中低水平存在（Kaur 1986）；然而，已經(jīng)報道在南瓜派中發(fā)現其不尋常的高耐熱性（Wyatt and Guy 1981）。對特定產(chǎn)品應該進(jìn)行蠟樣芽孢桿菌生存潛力的評估。

•  歷史上蠟樣芽胞桿菌食源性疾病與米飯和土豆有關(guān)聯(lián)，因此含米飯或土豆的產(chǎn)品應評估時(shí)間/溫度的控制要求。

彎曲桿菌：不推薦用于挑戰實(shí)驗，因為其它微生物如沙門(mén)氏菌與其有類(lèi)似的污染路徑，而且更容易培養，也不需要復雜的營(yíng)養物。此外，彎曲桿菌最低生長(cháng)溫度32℃（90°F）和水分活度0.98，使它不太可能成為挑戰使用的候選對象。

肉毒桿菌：推薦的要求在目前的方法下毒素不可以形成。其他注意事項：對特定的熟制品要適當考慮肉毒梭菌，尤其是MAP包裝產(chǎn)生的無(wú)氧和微氧條件下的產(chǎn)品；如浸油食品和焙烤馬鈴薯都曾暴發(fā)過(guò)此類(lèi)食源性疾病。

產(chǎn)氣莢膜梭菌：一個(gè) 3個(gè)對數值的增殖基于下列因素：

•  雖然其他產(chǎn)品可能含有存活的孢子，與產(chǎn)氣莢膜梭菌相關(guān)的主要是肉禽制品，包括醬和調味肉汁。依據食品法典大部分生鮮產(chǎn)品要求熟制。

•  肉禽制品內的產(chǎn)氣莢膜梭菌營(yíng)養細胞很容易被烹調殺滅，而孢子由于形成條件苛刻通常含量較低。在平板上培養一個(gè)最差的情況下初始水平為100CFU/ g。增殖到> 105CFU / g會(huì )導致食源性疾��；因此為控制危害增殖不能超過(guò)3個(gè)對數值。

腸出血性大腸桿菌：如果預測病原體增殖用模型程序，因該微生物的感染性應保持儲存的時(shí)間/溫度條件使腸出血大腸桿菌在遲滯期。然而，如果用于實(shí)驗室挑戰實(shí)驗時(shí)， <1個(gè)對數值的漸進(jìn)生長(cháng)作為定量方法自身的變異指示增殖已被控制。

李斯特氏菌：最近的風(fēng)險評估（FDA / USDA 2001）表明，較低水平的單增李斯特氏菌對公眾健康呈現低風(fēng)險。認識到這一點(diǎn)，一些國家如：加拿大和德國建立了允許這種微生物在某些即食食品中低水平存在，但不許增殖到很高的水平。然而，在美國對這些類(lèi)型的食品尚未建立一個(gè)李斯特氏菌限量。人們還認識到，支持微生物生長(cháng)的那些產(chǎn)品呈現的風(fēng)險增加。食用時(shí)100 CFU / g的單增李斯特氏菌限量可滿(mǎn)足保護消費者一個(gè)可接受的水平（Ross and others 2000）。然而，數據不足以確定最壞情況下該菌存在的通常初始水平�？傮w而言，該小組得出的結論是李斯特氏菌1個(gè)對數值的增長(cháng)控制水平是適當的。這個(gè)水平基于枚舉技術(shù)的變異，代表的觀(guān)點(diǎn)是該菌高水平的增殖表明會(huì )危害到公眾健康時(shí)必須加以控制。

沙門(mén)氏菌：驗證恰當地病原體生長(cháng)模型程序可用于核實(shí)沙門(mén)氏菌屬處在遲滯期內。否則，同腸出血性大腸桿菌一樣增殖量應被限制在<1個(gè)對數值內。

志賀氏菌：志賀氏菌不推薦用于挑戰實(shí)驗，因為它與沙門(mén)氏菌屬具有相同的潛在來(lái)源，并具有苛刻的生長(cháng)和生存條件。

金黃色葡萄球菌：評估實(shí)驗用的時(shí)間/溫度應不產(chǎn)生可檢測到的毒素。目前用于毒素檢測的方法和測定特定毒素的含量同肉毒梭菌一樣。采用限制增殖<3個(gè)對數值來(lái)替代毒素測試。這個(gè)限制的生長(cháng)水平是基于初始菌群為1000CFU/ g和最小需要10 6 CFU / g才產(chǎn)生毒素。

其他注意事項：挑戰實(shí)驗用金黃色葡萄球菌是適合的，因為其作為食源性疾病獲得廣泛地研究。金黃色葡萄球菌不適于與其他微生物競爭；因此，當食品中含有其他高濃度的微生物時(shí)，其不適于作挑戰實(shí)驗，如生菜或經(jīng)過(guò)發(fā)酵的食品。

弧菌：驗證恰當地病原體生長(cháng)模型程序可用于核實(shí)弧菌處在遲滯期內。否則，同大腸桿菌一樣增殖量應被限制在<1個(gè)對數值內。

副溶血性弧菌：對于海洋食品挑戰實(shí)驗可以用副溶血性弧菌替代其他弧菌。應當指出的是大多數魚(yú)類(lèi)高度易腐爛，因此控制溫度是防止變質(zhì)的原因。

小腸結腸炎耶爾森菌：不推薦用于沙門(mén)氏菌屬的挑戰實(shí)驗。小腸結腸炎耶爾森菌和沙門(mén)氏菌具有相似的來(lái)源，而沙門(mén)氏菌更容易培養。

表6-1 各種食品挑戰實(shí)驗中可以考慮采用的病原體

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