免疫血清的制備

一、實(shí)驗目的和內容
目的：學(xué)習和掌握免疫血清的制備方法，為凝集反應和沉淀反應準備凝集素和沉淀素。
內容：1、抗大腸桿菌血清(凝集素)的制備。
2、牛血清白蛋白抗血清(沉淀素)的制備。
二、實(shí)驗材料和用具
體重2~3kg的健康雄家兔、大腸桿菌(E.  coli)斜面菌種；
牛血清白蛋白(蛋白含量1.5mg/mL)、牛肉膏蛋白胨斜面培養基、0.3%甲醛液(用0.85%生理鹽水配制)、75%酒精棉球、碘酒棉球、消毒干棉球；
細菌比濁標準管、無(wú)菌吸管、無(wú)菌注射器(5mL、20mL)、注射針頭(5號，B19)、無(wú)菌試管、裝有玻璃珠的無(wú)菌血清瓶、解剖用具(解剖臺、兔頭夾、止血鉗、解剖刀、眼科剪刀、鑷子、動(dòng)脈夾等)、雙面刀片、絲線(xiàn)、玻璃管、膠管、離心機及無(wú)菌離心管、普通冰箱、超凈工作臺、水浴箱。
三、操作步驟
(一)凝集素的制備
1．凝集原(顆粒性抗原)的制備
(1)取37C恒溫培養24h的牛肉膏蛋白胨大腸桿菌斜面。
(2)每支斜面菌種中加入5mL0.3%甲醛液，小心地把菌苔洗下制成菌液。
(3)用無(wú)菌清潔吸管，吸取以上菌液，注入裝有玻璃珠的無(wú)菌血清瓶?jì)�，振�?0~25min，分散菌塊制成菌懸液。
(4)將含菌懸液的血清瓶置于60℃的水浴箱中水浴1h，并不時(shí)搖動(dòng)，把菌殺死。
(5)將菌懸液重新接種至牛肉膏蛋白胨斜面培養基中，37℃培養24～48h，如有菌生長(cháng)，則要在60℃水溫中再處理。若無(wú)菌生長(cháng)則進(jìn)行比濁測定其含菌量。
(6)凝集素的制備
(1)免疫方法：選擇2～3kg健康雄免，從耳緣靜脈采血2mL，分離出血清。該血清與準備免疫用的抗原進(jìn)行凝集反應，以檢查有無(wú)天然凝集素。如沒(méi)有或只有極微量時(shí)，該動(dòng)物便可用來(lái)免疫。
最常用的免疫途徑是耳緣靜脈注射。將家兔放在家兔固定箱內，一手輕輕拿起耳朵，用碘酒棉花球在耳外側邊緣靜脈處消毒，然后用酒精棉球涂擦，并用手指輕輕彈幾下靜脈血管，使其擴張。消毒細菌懸液瓶塞后，用無(wú)菌注射器及5號針頭吸取菌液，沿著(zhù)靜脈平行方向刺入靜脈血管，并慢慢注入菌液，注射完畢，用干棉球按壓住注射處，然后撥出針頭，并壓迫血管注射處片刻，以防止血液向外溢出。注射時(shí)發(fā)現注射處隆起，不易推進(jìn)時(shí)，表明針尖不在血管中，應撥出針頭，重找位置再注射。有時(shí)針尖口被堵塞，菌液推不進(jìn)去，應及時(shí)更換針頭。注射途徑、劑量和日程安排等視抗原和動(dòng)物不同而有所不同。大腸桿菌免疫家兔的抗原注射劑量和日程安排如下表：
日期 第1日 第2日 第3日 第4日 第5日
注射劑量/mL 0.2 0.4 0.6 1.0 2.0
(2)試血：通常于最后一次注射后7~11d，從兔耳緣靜脈抽取2mL血，分離析出血清，用試管凝集反應測定抗血清效價(jià)。效價(jià)合格即可大量采血，如效價(jià)不高，可繼續注射抗原免疫，提高效價(jià)。
(3)采血：采血分為心臟采血和頸動(dòng)脈放血。
心臟采血：使免疫家兔仰臥于臺上，四肢固定。用左手探明心臟博動(dòng)最明顯處，用碘酒棉球與酒精棉球消毒后，右手握消毒過(guò)的20mL注射器和B19號針頭，在上述部位的肋骨間隙與胸部呈45°角刺入心臟，微微抽取針筒，此時(shí)可發(fā)現血液涌入注射器中便可徐徐抽取血液。2.5kg家兔一次可取血20~30mL。取血完畢后，用消毒棉球按壓進(jìn)針處迅速撥出針頭，進(jìn)針處用棉球繼續壓住。并馬上將所采的血液注入無(wú)菌大試管內，斜放，待血液凝固后，置于37℃恒溫箱中30min，使血清充分析出，然后放入4~6C冰箱中。
頸動(dòng)脈采血：將免疫家兔固定于兔臺上，用少量乙醚麻醉，剪去頸部的毛，然后用碘酒棉球和酒精棉球消毒。沿正中線(xiàn)將頸部皮膚切開(kāi)到鎖骨間，撥開(kāi)肌膜，暴露出氣管，在氣管深側處找到搏動(dòng)的頸動(dòng)脈。小心地將頸動(dòng)脈和迷走神經(jīng)剝離分開(kāi)4~5cm。用鑷子拉出頸動(dòng)脈，用絲線(xiàn)扎緊血管的離心端，在血管的向心端用止血鉗夾住。然后用眼科剪在絲線(xiàn)與止血鉗之間的血管上剪一個(gè)V型小切口，將彎咀眼科鑷自切口插入，使其張開(kāi)，同時(shí)將一小玻管插入，用絲線(xiàn)扎緊，以防玻管脫漏。玻管另一端接入一條膠管，膠管通入大試管(或大離心管)內，然后將止血鉗慢慢松開(kāi)，使血液流入試管，直至動(dòng)物死亡，無(wú)血液流出為止。
(4)抗血清分離與保存：取凝固血液于4000r/min，離心20min，獲得抗血清(即凝集素)。加入石炭酸或硫柳汞使其濃度分別達到0.5%或0.01%。測定抗血清的效價(jià)后，封好瓶口，貼好標簽，注明抗血清名稱(chēng)、效價(jià)及日期，置冰箱保存備用。
(二)沉淀素的制備
抗原為可溶性抗原(如脂多糖、類(lèi)毒素或可溶性蛋白等)。通常每kg兔體重注射2mg蛋白，牛血清白蛋白抗原濃度為1.5mg/mL，則2.5kg兔應注射5mg蛋白。免疫方法、采血方法和抗血清(沉淀素)的分離可參照凝集素制備方法，但效價(jià)測定則用沉淀反應來(lái)測定。
四、注意事項
由于每個(gè)動(dòng)物對免疫反應不同，產(chǎn)生的抗體效份有高有低，所以在制備抗血清時(shí)至少免疫兩只家兔。如須保留該免疫動(dòng)物，剛采取心臟直接取血，取血后應從靜脈注射等體積的50%葡萄糖溶液，經(jīng)過(guò)2~3個(gè)月的飼養，方可再次免疫。若不保留動(dòng)物須一次取大量血時(shí)，則采用頸動(dòng)脈放血法。
五、演示
1．耳緣靜脈注射抗原的方法。
2．心臟取血的操作過(guò)程。
六、實(shí)驗報告
1．記錄免疫家兔的操作過(guò)程及免疫過(guò)程中兔的反應。
2．實(shí)驗操作過(guò)程的體會(huì )。
七、問(wèn)題和思考
1．如果不用生理鹽水來(lái)配制抗原，以這樣的抗原免疫兔成不成？為什么？
2．現有一支蘇云金桿菌(Bacillus thuringinesis)斜面菌種，你能否制備出相應的凝集素？闡述其主要步驟。
   
   

 

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