種測定抗菌藥物最低抑菌濃度（MIC）方法

1.1.常量肉湯稀釋法

1.1.1.抗菌藥物貯存液制備 抗菌藥物貯存液濃度不應低于1000μg/ml(如1280μg/ml)或10倍于最高測定濃度。溶解度低的抗菌藥物可稍低于上述濃度�？咕�藥物直接購自廠(chǎng)商或相關(guān)機構。所需抗菌藥物溶液量或粉劑量可公式進(jìn)行計算。例如：需配制100 ml濃度為1280μg/ml的抗生素貯存液，所用抗生素為粉劑，其藥物的有效力為750μg/mg。用分析天平精確稱(chēng)取抗生素粉劑的量為182.6 mg。根據公式計算所需稀釋劑用量為：（182.6 mg×750μg/ml）/1280μg/ml=107.0ml，然后將182.6 mg抗生素粉劑溶解于107.0ml稀釋劑中。制備抗菌藥物貯存液所用的溶劑和稀釋劑見(jiàn)表5。配制好的抗菌藥物貯存液應貯存于-60℃以下環(huán)境，保存期不超過(guò)6個(gè)月。

1.1.2.藥敏試驗用抗菌藥物濃度范圍 根據NCCLS抗菌藥物敏感性試驗操作標準，藥物濃度范圍應包含耐藥、中介和敏感分界點(diǎn)值，特殊情況例外。

1.1.3. 培養基 NCCLS推薦使用Mueller-Hinton（MH）肉湯，pH7.2~7.4。需氧菌及兼性厭氧菌在此培養基中生長(cháng)良好。在測試葡萄球菌對苯唑西林的敏感性時(shí)，應在肉湯中加入2%（W/V）氯化鈉，按制造廠(chǎng)家的要求配制需要量的MH肉湯。嗜血桿菌屬菌使用HTM肉湯，肺炎鏈球菌和其它鏈球菌使用含2%~5%溶解馬血的MH肉湯。

1.1.4.接種物的制備 有2種方法配制接種物，一是細菌生長(cháng)方法，用接種環(huán)挑取形態(tài)相似待檢菌落3-5個(gè)，接種于4-5ml的水解酪蛋白（MH）肉湯中，35℃孵育2-6h。增菌后的對數生長(cháng)期菌液用生理鹽水或MH肉湯校正濃度至0.5麥氏比濁標準，約含1~2×108CFU/ml。二是直接菌落懸液配制法，對某些苛養菌，如流感嗜血桿菌、淋病奈瑟菌和鏈球菌及甲氧西林耐藥的葡萄球菌等菌株，推薦直接取培養18~24h的菌落調配成0.5麥氏比濁標準的菌懸液。用MH肉湯將上述菌懸液進(jìn)行1∶100稀釋后備用。注意應在15分鐘內接種完配制好的接種物，并取一份接種物在非選擇性瓊脂平板上傳代培養，以檢查接種物純度。

1.1.5.稀釋抗菌藥物的制備及菌液接種 取無(wú)菌試管（13×100mm）13支，排成一排，除第1管加入1.6mlMH肉湯外，其余每管加入MH肉湯1ml，在第1管加入抗菌藥物原液（如1280μg/ml） 0.4ml混勻，然后吸取1ml至第2管，混勻后再吸取1ml至第3管，如此連續倍比稀釋至第11管，并從第11管中吸取1ml棄去，第12管為不含藥物的生長(cháng)對照。此時(shí)各管藥物濃度依次為256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25μg/ml。然后在每管內加入上述制備好的接種物各1ml，使每管最終菌液濃度約為5×105CFU/ml。第1管至第11管藥物濃度分別為128、64、32、16、8、4、2、1、05、0.25、0.125μg/ml。

1.1.6.孵育 將接種好的稀釋管塞好塞子，置35℃普通空氣孵箱中孵育16~20h；嗜血桿菌和鏈球菌在普通空氣孵箱中孵育20~24h；對可能的耐甲氧西林葡萄球菌和耐萬(wàn)古霉素腸球菌應持續孵育滿(mǎn)24h。

1.1.7.結果判斷與解釋 在讀取和報告所測試菌株的MIC前，應檢查生長(cháng)對照管的細菌生長(cháng)情況是否良好，同時(shí)還應檢查接種物的傳代培養情況以確定其是否污染，質(zhì)控菌株的MIC值是否處于質(zhì)控范圍。以肉眼觀(guān)察，藥物最低濃度管無(wú)細菌生長(cháng)者，即為受試菌的MIC。甲氧芐胺嘧啶或磺胺藥物的肉湯稀釋法終點(diǎn)判斷，與陽(yáng)性生長(cháng)對照管比較抑制80%細菌生長(cháng)管藥物濃度為受試菌MIC。

根據NCCLS推薦的分界點(diǎn)值標準，判斷耐藥（resistant, R）、敏感(susceptible, S)或中介（intermediate, I）。S表示被測菌株所引起的感染可以用該抗菌藥物的常用劑量治療有效，禁忌癥除外。R指該菌不能被抗菌藥物的常用劑量在組織液內或血液中所達到的濃度所抑制，或屬于具有特定耐藥機理（如β-內酰胺酶），所以臨床治療效果不佳。I是指MIC接近藥物的血液或組織液濃度，療效低于敏感菌。還表示被測菌株可以通過(guò)提高劑量（如β-內酰胺類(lèi)藥物）被抑制，或在藥物生理性濃集的部位（如尿液）被抑制。另外，中介還作為“緩沖域”，以防止由微小的技術(shù)因素失控，所導致較大的錯誤解釋。

1.2.微量肉湯稀釋法

1.2.1.抗菌藥物和培養基制備 同常量肉湯稀釋法。

1.2.2.MIC板制備 無(wú)菌操作，將倍比稀釋后不同濃度的抗菌藥物溶液分別加到滅菌的96孔聚苯乙烯板中，第1至第11孔加藥液，每孔10μl，第12孔不加藥作為生長(cháng)對照，冰凍干燥后密封，-20℃以下保存備用。

1.2.3.接種物制備 將用生長(cháng)法或直接菌懸液法制備的濃度相當于0.5麥氏比濁標準的菌懸液，經(jīng)MH肉湯1∶1000稀釋后，向每孔中加100μl，密封后置35℃普通空氣孵箱中，孵育16~20h判斷結果。當試驗嗜血桿菌屬，鏈球菌屬時(shí)，孵育時(shí)間為20~24h，試驗葡萄球菌和腸球菌對苯唑西林和萬(wàn)古霉素的藥敏試驗時(shí)孵育時(shí)間必須滿(mǎn)24h。此時(shí)，第1孔至第11孔藥物濃度分別為128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125μg/ml。

1.2.4.結果判斷 以在小孔內完全抑制細菌生長(cháng)的最低藥物濃度為MIC。當陽(yáng)性對照孔（即不含抗生素）內細菌明顯生長(cháng)試驗才有意義。當在微量肉湯稀釋法出現單一的跳孔時(shí)，應記錄抑制細菌生長(cháng)的最高藥物濃度。如出現多處跳孔，則不應報告結果，需重復試驗。通常對革蘭陰性桿菌而言，微量肉湯稀釋法測得的MIC與常量肉湯稀釋法測得的結果相同或低一個(gè)稀釋度（1孔或2倍）。

2.瓊脂稀釋法 瓊脂稀釋法是將不同劑量的抗菌藥物，加入融化并冷至50℃左右的定量MH瓊脂中，制成含不同遞減濃度抗菌藥物的平板，接種受試菌，孵育后觀(guān)察細菌生長(cháng)情況，以抑制細菌生長(cháng)的瓊脂平板所含最低藥物濃度為MIC。本法優(yōu)點(diǎn)是可在一個(gè)平板上同時(shí)作多株菌MIC測定，結果可靠，易發(fā)現污染菌；缺點(diǎn)是制備含藥瓊脂平板費時(shí)費力。

2.1.培養基制備 使用MH瓊脂，按商品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行配制，pH7.2~7.4。淋病奈瑟菌使用GC瓊脂基礎加1%添加劑；其它鏈球菌使用含5%（V/V）綿羊血的MH瓊脂（當試驗磺胺藥時(shí)，使用溶解的馬血）。

2.2.含藥瓊脂平板制備 根據實(shí)驗設計，將已倍比稀釋的不同濃度的抗菌藥物分別加入已加熱溶解，并在45~50℃水浴中平衡的MH瓊脂中，充分混勻傾倒滅菌平皿，瓊脂厚度3~4mm。通常按1∶9比例配制藥物瓊脂平板，根據需要來(lái)選擇藥物濃度范圍。配制好的含藥瓊脂平板應裝入密封塑料袋中，置2~8℃冰箱可貯存5天。

2.3.接種物制備與接種 制備濃度相當于0.5麥氏標準比濁管的菌懸液，再1∶10稀釋?zhuān)�以多點(diǎn)接種器吸取制備好菌液（約1~2μl）接種于瓊脂平板表面，每點(diǎn)菌數約為104CFU，形成直徑為5~8mm的菌斑。接種好后置35℃孵育16~20h（甲氧西林耐藥葡萄球菌、萬(wàn)古霉素耐藥腸球菌孵育時(shí)間應滿(mǎn)24h），觀(guān)察結果。奈瑟菌屬、鏈球菌屬細菌置5%二氧化碳、幽門(mén)螺桿菌置微需氧環(huán)境中孵育。

2.4.結果判斷 將平板置于暗色、無(wú)反光物體表面上判斷試驗終點(diǎn)，以抑制細菌生長(cháng)的最低藥物濃度為MIC。在含甲氧芐胺嘧啶或磺胺瓊脂平板上可見(jiàn)輕微細菌生長(cháng)，與生長(cháng)對照比較抑制80%以上細菌生長(cháng)的最低藥物濃度作為終點(diǎn)濃度。

如果出現有2個(gè)以上菌落生長(cháng)于含藥濃度高于終點(diǎn)水平的瓊脂平板上，或低濃度藥物瓊脂平板上不長(cháng)而高濃度藥物瓊脂平板上生長(cháng)現象，則應檢查培養物純度或重復試驗。

3.E試驗（E-test） E試驗是指濃度梯度瓊脂擴散試驗，其原理基本同擴散法，即濃度呈連續梯度的抗菌藥物從塑料試條中向瓊脂中擴散，在試條周?chē)�抑菌濃度范圍內受試菌的生長(cháng)被抑制，從而形成透明的抑菌圈。E試驗綜合了稀釋法和擴散法的原理和特點(diǎn)，同時(shí)還彌補了二者的一些不足，可以像稀釋法一樣直接定量測出抗菌藥物對受試菌的MIC。

3.1.培養基、菌液制備和接種 同紙片擴散法。

3.2.貼E試驗條 同紙片擴散法，E試驗條的刻度面朝上，不得貼反，一旦接觸瓊脂后不得再移動(dòng)。直徑150mm的平皿內可放置6根E試驗試條，90mm者一般只能放置1根。

3.3.孵育時(shí)間和溫度 同紙片擴散法。

3.4.結果閱讀 孵育后圍繞試條可形成一個(gè)橢圓形的抑菌圈，在抑菌圈和試條的橫切相交處試條上的讀數刻度即是測定抗菌藥物對受試菌的MIC。

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