PCR檢測技術(shù)

一、概述

    PCR又稱(chēng)聚合酶鏈式反應(Polymerase chain reaction)，是1985年由美國的Kary Mullis首創(chuàng )并由美國Cetus公司開(kāi)發(fā)的一項體外擴增DNA的方法。應用該方法可使極微量的特定DNA片段在幾小時(shí)內迅速擴增至百萬(wàn)倍，因而一經(jīng)問(wèn)世便在短短的數年內就得到了迅速發(fā)晨和實(shí)際應用，并在原有基礎上結合各種生化分子生物學(xué)技術(shù)衍生出了許多改良技術(shù)。這些技術(shù)顯示出了巨大的潛力，發(fā)揮著(zhù)越來(lái)越大的作用，也正因為如此它們被譽(yù)為20世紀80年代分子生物學(xué)革命和生物技術(shù)的飛躍。

（一）PCR原理

     PCR是依據DNA模板的特性，模仿體內的復制過(guò)程，在體外合適的條件下以單鏈DNA為模板，以人工設計和合成的寡核苷酸為引物，利用熱穩定的DNA聚合酶延5’-3’方向摻人單核苷酸來(lái)特異性的擴增DNA片段的技術(shù)。

（二）PCR反應體系

     PCR反應體系主要由引物、dNTP、DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)、緩沖液、Mg2+和核酸模板組成。

（三）PCR反應參數

     在PCR反應中每輪循環(huán)的各步反應時(shí)間不應過(guò)長(cháng)，以免降低TaqDNA聚合酶的活性。下面介紹PCR反應中的一些具體參數。

1.變性    

2.退火  

3.延伸  

4.循環(huán)次數

（四）常見(jiàn)的PCR種類(lèi)

1.熱啟動(dòng)PCR    

2.一步單管PCR    

3.多重PCR

4.依賴(lài)PCR的DNA指紋圖譜技術(shù)  

5.PCR-單鏈構想多態(tài)性分析

6.mRNA差異顯示技術(shù)  

7.隨機引物擴增DNA多態(tài)性（RAPD）

8.以微衛星DNA介導的PCR技術(shù)

9.基因間重復性回文片段（REP）和基因內重復性一致序列（ERIC）的擴增

10.擴增片段長(cháng)度多態(tài)性分析（AFLP）

11.限制性長(cháng)度多態(tài)性分析（RFLP）

12.用于RNA病毒檢測的核酸擴增技術(shù)

（五）PCR技術(shù)用于檢測的主要步驟

（1）運用化學(xué)手段對目標DNA進(jìn)行提取。

（2）設計并合成引物，引物設計或合成的好壞直接決定PCR擴增的成效。

（3）進(jìn)行PCR擴增。

（4）克隆并篩選鑒定PCR產(chǎn)物，將擴增產(chǎn)物進(jìn)行電泳、染色，在紫外光照射下可見(jiàn)擴增特異區段的DNA帶．根據該帶的不同即可鑒定不同的DNA。

（5）DNA序列分析

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