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1、 檢驗用菌種的選擇
在藥典第三次征訂意見(jiàn)稿《9203 藥品微生物實(shí)驗室質(zhì)量管理指導原則》的“菌種”項下有這么一句話(huà)“藥品微生物檢驗用的試驗菌應來(lái)自認可的國內或國外菌種保藏機構的標準菌株，或使用與標準菌株所有相關(guān)特性等效的可以溯源的商業(yè)派生菌株”。這句話(huà)寫(xiě)明了中國藥典對檢驗用菌種的挑選原則，感覺(jué)上可以使用CMCC（中國醫學(xué)微生物菌種保藏管理中心）、ATCC（美國典型菌種保藏中心）、NCTC（英國典型菌種保藏中心）等等，最近還有供應商給我推薦CICC（中國工業(yè)微生物保藏中心）的菌種。但是我們作為遵循中國藥典的企業(yè)來(lái)說(shuō)，中國藥典微生物限度及無(wú)菌檢查項下的菌種是明確寫(xiě)明僅可使用CMCC的菌種，所以大家沒(méi)有必要去挑戰權威性，如果你使用ATCC的菌種，檢查官到時(shí)候問(wèn)你ATCC和CMCC的區別，我相信我們這種等級的肯定是說(shuō)不清的，這個(gè)項目是中檢所在做的研究，所以我們不去做這樣的挑戰，乖乖的選擇符合我國國情的CMCC菌種即可，免去一系列無(wú)意義的解釋。
當然有些企業(yè)的產(chǎn)品需要出口，要符合出口國的藥典標準，國外相對來(lái)說(shuō)就放寬很多，但是也有一部分國家不太承認我們的CMCC菌種。在我的工作經(jīng)歷中，發(fā)現國內的審計官員對微生物方面了解的甚少，但是有次我們企業(yè)請了一名國外資深專(zhuān)家來(lái)我們公司全面審計的時(shí)候，他一看我們檢出的環(huán)境菌種就娓娓道來(lái)，讓我很吃驚，我不知道是不是國外對于微生物這塊的重視程度和我國還有一定差距還是什么，他們的藥典中對于檢驗菌種的挑選也不止一種，認可范圍更加寬泛�，F在迎審過(guò)程中，我們微生物實(shí)驗室更多的是解釋而非探討，我們也希望國內的檢查團隊中能多一些對微生物了解的老師來(lái)給我們幫助和指導。
2、 檢驗用菌種的管理
我們實(shí)驗室對于菌種的管理也歷經(jīng)了不少波折，現在的管理模式和使用下來(lái)的效果還是比較令人滿(mǎn)意的，菌種其實(shí)最怕就是其活力消退或變異。有些外企的管理模式真的非常方便，使用定量菌株直接實(shí)驗，可能現在還不太適用于我們大部分國內企業(yè)，因為他們使用的定量菌株是ATCC等授權的國外企業(yè)制造并供貨的，確實(shí)非常精準，特別是M家的首席產(chǎn)品，我就不多說(shuō)了以免有廣告嫌疑，國內應運而生的定量菌株我個(gè)人還是保留意見(jiàn)。出去培訓時(shí)還是會(huì )發(fā)現有很多國內企業(yè)對于菌種的管理方式特別是保藏方法存在一定問(wèn)題，菌種死亡變異的事件還是時(shí)有發(fā)生。以下我就介紹下我們企業(yè)的菌種管理模式，并介紹2種比較方便的菌種保藏方法。
藥典的標準菌株大部分企業(yè)都會(huì )有以下七種：金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉，這些菌種我們是依據保藏的效期，在每年的年末購買(mǎi)一次，購買(mǎi)的是次年要過(guò)保藏效期的標準儲備菌株。這里大家可能就會(huì )有疑問(wèn)了，為什么我們只有標準儲備菌株，那是因為我們只購買(mǎi)CMCC標準菌株，即0代菌株，僅保藏使用0代復蘇出來(lái)的1代標準儲備菌株，使用的即是1代標準儲備菌株復蘇的2代菌株，這樣的話(huà)最大程度上避免活力及變異事件的發(fā)生，因為實(shí)驗室日常也沒(méi)有精力去處理這些事情，所以在10版藥典的時(shí)候，我們就把管理模式重新調整了一下，整個(gè)流程為菌株申購→菌株驗收→菌株確認→菌株保藏→菌株領(lǐng)用→菌株使用→菌株銷(xiāo)毀。
1） 菌株申購
購買(mǎi)檢驗用菌株，必須由檢驗用菌株的管理人員提出申請、陽(yáng)性室負責人審核、部門(mén)經(jīng)理批準后方可進(jìn)行購買(mǎi)，公司的采購人員必須憑著(zhù)被簽批的單子才能夠進(jìn)行菌種的購買(mǎi)，因為這畢竟關(guān)系到生物安全問(wèn)題，所以申購必須慎重。
2） 菌株驗收
每支過(guò)來(lái)的0代安瓿必須經(jīng)過(guò)確認，實(shí)驗室至少要進(jìn)行菌落形態(tài)和革蘭氏染色的實(shí)驗，有條件的話(huà)通過(guò)生化或其他方法確認到屬種。該實(shí)驗是確認菌株的純度、活力和特性，我們是確認復蘇后的1代標準儲備菌株，即我們保藏的菌株，保證保藏的菌株的質(zhì)量。
3） 菌株保藏
其實(shí)在確認同時(shí)我們即進(jìn)行了保藏，若確認不合格，則銷(xiāo)毀該批次保藏批的菌株，我們實(shí)驗室的保藏方法很簡(jiǎn)單，也是借鑒08-09年我的領(lǐng)導去中檢所培訓帶回來(lái)的保藏方法，即使用液體培養基復蘇菌液，然后加入等量的20%甘油，制成含10%甘油的菌懸液，然后分裝至1ml/支，可以保存2年，但是黑曲霉我們是保藏孢子懸液，貯存于-15℃以下，有效期是1年。
現在也有很多實(shí)驗室使用磁珠法保藏也是覺(jué)得效果不錯，其保藏后貯存在2-8℃，效期1年。
兩個(gè)方法各有利弊，甘油冷凍法每次實(shí)驗使用一支，不會(huì )重復使用，避免重復凍融對菌株的挑戰以及重復開(kāi)管引入的污染；但是磁珠法因為是好幾顆磁珠放在一管保存液里，每次使用會(huì )從該管里夾取一粒復蘇，可能重復操作引入污染，但是其優(yōu)勢在于對冰箱溫度要求不高，一般實(shí)驗室都有滿(mǎn)足2-8℃的冰箱，而甘油冷凍管需要冷凍室進(jìn)行保存，所以對沒(méi)有—15℃以下溫度保證的實(shí)驗室來(lái)說(shuō)，還需購買(mǎi)相應設備，這個(gè)就是各自實(shí)驗室去評估選擇了。
這里我還是不太建議使用斜面，一兩個(gè)月就要轉一次，日常事情較多且對于菌株的確認其實(shí)在傳代過(guò)程中也需要進(jìn)行實(shí)驗確認，這樣又帶來(lái)附加實(shí)驗，一支買(mǎi)來(lái)的商業(yè)派生菌株（一般在省所買(mǎi)來(lái)的最少也是2代了，基本都會(huì )是3代這種）管不了太久又需要買(mǎi)了，本來(lái)很多微生物實(shí)驗室人手就不夠，轉種的多還要多配培養基，沒(méi)必要把精力放在這些事情上，如果實(shí)驗室沒(méi)有冷凍冰箱，那可以考慮磁珠法，有的話(huà)可以考慮甘油冷凍法，這樣可以把工作菌株的使用有效期延長(cháng)到1-2年。
還有要提一下保藏培養基的問(wèn)題，之前金葡、大腸、枯草、銅綠都是使用營(yíng)養肉湯，生孢使用硫乙醇，白念使用馬丁，黑曲霉使用TSA進(jìn)行復蘇，15版使用TSB、SDB、SDA了，我暫時(shí)不考慮更換細菌培養基，因為畢竟使用那么多年保藏效果比較理想，而且TSB有糖的問(wèn)題，不過(guò)我還是覺(jué)得營(yíng)養肉湯早晚會(huì )退出歷史舞臺，與其等到那時(shí)候束手無(wú)策，畢竟菌株保藏都是以年來(lái)計算的，到時(shí)候沒(méi)得賣(mài)就完蛋了，還不如把事情做在前面，在保證菌株儲備齊全的情況下，同步要挑戰使用TSB保藏金葡、大腸、枯草、銅綠的實(shí)驗（至少1年），生孢依舊硫乙醇，白念使用SDB，黑曲霉使用SDA。還有使用新的培養基復蘇的菌濃問(wèn)題，基本都比老的長(cháng)的好，各個(gè)實(shí)驗室可以先行試一下。
4） 菌株領(lǐng)用
我們保藏菌株的冰箱是雙人雙鎖，2 把鎖分別在陽(yáng)性實(shí)驗人員及陽(yáng)性室負責人手上，日常取用菌株進(jìn)行實(shí)驗必須2人到場(chǎng)開(kāi)冰箱取菌株，并在菌株領(lǐng)用臺賬上說(shuō)明領(lǐng)用日期、原因、領(lǐng)用人等信息，保證菌株的流通可控。
5） 菌株使用
說(shuō)到菌株使用我覺(jué)得我還是有些實(shí)驗潔癖的，很多實(shí)驗室是在生物安全柜內幾個(gè)菌一起做，比如今天有3個(gè)菌的實(shí)驗，都會(huì )安排在一起做。但是在我們實(shí)驗室，我是嚴格要求在A(yíng)菌和B菌之間必須清場(chǎng)，A菌實(shí)驗使用的稀釋液、槍頭盒等必須撤離現場(chǎng)，消毒安全柜后開(kāi)紫外燈30min以上，才可進(jìn)行B菌株實(shí)驗，并且B菌實(shí)驗使用的肯定不能是A菌實(shí)驗使用余下的那些稀釋液和槍頭。因為實(shí)驗時(shí)產(chǎn)生的氣溶膠是我們肉眼看不見(jiàn)的，雖然在混勻菌液時(shí)候我們是蓋緊試管蓋的，但是在打開(kāi)蓋時(shí)我無(wú)法判斷是否有帶菌氣溶膠跑到空氣中沾到哪里，我承認只要是無(wú)菌操作過(guò)關(guān)是不會(huì )交叉污染的，但是我不敢冒這個(gè)險，還是老老實(shí)實(shí)遵循著(zhù)避免交叉污染的宗旨，就和生產(chǎn)清場(chǎng)的概念一樣。
還要提一下黑曲霉，其實(shí)國內有很多廠(chǎng)家還沒(méi)有購買(mǎi)黑曲霉，當時(shí)他們問(wèn)我的時(shí)候，我真的很奇怪他們怎么通過(guò)新版GMP審核的，這個(gè)暫且不論，反正我們實(shí)驗對黑曲霉的處理倒是挺順利的，當時(shí)10版藥典和中檢所SOP上都寫(xiě)著(zhù)用棉花放在管口防止孢子飛出什么的，我嫌麻煩，于是想了個(gè)法子，我們的試管是用膠質(zhì)的試管塞的，斜面上黑曲霉長(cháng)好后，用一次性注射器吸取稀釋液從試管塞與試管的縫隙中插進(jìn)去，因為試管塞是有彈性的，那么細的針頭是肯定能從其邊緣插進(jìn)去的，記得塞子始終保持緊閉，然后將液體打入管內直至覆蓋所有黑曲霉生長(cháng)的范圍，然后微微震蕩將孢子洗脫出來(lái)，洗脫后，將塞子打開(kāi)（因為所有菌體均以被液體覆蓋故孢子飛散可能性降低很多）使用槍頭或移液管吸取孢子懸液進(jìn)行稀釋即可，當然取原液時(shí)候的動(dòng)作應快速，減少其氣溶膠與空氣的接觸時(shí)間，至少我們實(shí)驗室沒(méi)有發(fā)生過(guò)一次污染，而且黑曲霉的實(shí)驗接入量控制的也很穩定。
對于菌株梯度稀釋定量的問(wèn)題，這里我就不多說(shuō)了，這個(gè)只有多加練習了，而且每個(gè)人的梯度確實(shí)會(huì )有偏差，我們實(shí)驗室是定好復蘇后的培養時(shí)間，比如金葡培養24h，那以后每次都是這個(gè)時(shí)間，這樣的菌濃一般都差不多，比較好控制，這個(gè)就是勤練！當然你的計數培養基必須質(zhì)量穩定，否則到時(shí)候因為計數培養基的質(zhì)量問(wèn)題而導致你一直認為自己稀釋的功夫不到家就沒(méi)話(huà)說(shuō)了。我們實(shí)驗室實(shí)驗都是當天直接稀釋并接種的，菌量的成功率還是很高的，當然實(shí)驗人員都是下了一定功夫的，特別是那個(gè)比較無(wú)語(yǔ)的50-100cfu。
黑曲霉的孢子懸液、枯草的芽孢懸液和生孢的芽孢懸液都是可以經(jīng)過(guò)驗證增加貯存時(shí)間的，具體的方法可以去網(wǎng)上查文獻，我覺(jué)得這個(gè)還是很有用的，使用起來(lái)很方便，關(guān)鍵減少工作量�。�！加個(gè)方法驗證即可，惡心小段時(shí)間，舒服大段時(shí)間！
6） 菌株銷(xiāo)毀
這里的菌株除了保藏的標準儲備菌株外，還有使用該菌株復蘇出的菌液、梯度稀釋的菌懸液以及菌株計數平皿，這些銷(xiāo)毀都是要記錄在案的，這個(gè)就是整個(gè)的流通過(guò)程，菌株的銷(xiāo)毀也是要經(jīng)過(guò)陽(yáng)性室負責人批準后執行，并且銷(xiāo)毀后還需要陽(yáng)性室負責人復核確認。
3、 菌種實(shí)驗室（生物安全實(shí)驗室）的認證及安全管理
在新版GMP中對于陽(yáng)性對照室有明確的規定，必須符合P2生物實(shí)驗室級別，現在還是有很多藥企的微生物實(shí)驗室對P2這個(gè)概念有點(diǎn)模糊，這里解釋一下，P2實(shí)驗室即二級生物安全實(shí)驗室，相當于BSL-2級病原微生物實(shí)驗室，該級別實(shí)驗室主要用于初級衛生服務(wù)、診斷和研究，其實(shí)驗對象的危害等級為Ⅱ級（中等個(gè)體危害，有限群體危害），具體定義為“能引起人類(lèi)或動(dòng)物發(fā)病，但一般情況下對健康工作者、群體、家畜或環(huán)境不會(huì )引起嚴重危害的病源體。實(shí)驗室感染不導致嚴重疾病，具備有效治療和 預防措施，并且傳播風(fēng)險有限”。這類(lèi)的實(shí)驗室就是P2級的實(shí)驗室。其實(shí)大家日常并不陌生，只是看到了沒(méi)注意而已，在各大醫院都是有生物安全實(shí)驗室的，只要是黃色醒目的標牌上面有生物安全標示（生化危機里的那個(gè)），上面寫(xiě)著(zhù)無(wú)關(guān)人員不得入內等，那就是生物安全實(shí)驗室了。
剛剛提到了P2實(shí)驗室相當于就是BSL-2級病原微生物實(shí)驗室，那我們的陽(yáng)性室基本上應該都是要符合BSL-2級病原微生物實(shí)驗室的，BSL-2級病原微生物實(shí)驗室是可以在各省市或區縣的衛生局進(jìn)行認證備案的，那也就是說(shuō)如果檢查官問(wèn)你，請問(wèn)你們實(shí)驗室是否符合P2實(shí)驗室的生物安全要求，那你不用多做解釋?zhuān)恍鑼SL-2級病原微生物實(shí)驗室的備案證書(shū)給他就可以了，在前面列舉的那些如銅綠假單胞菌、白色念珠菌均屬于BSL-2級病原微生物，這個(gè)備案也需要一定過(guò)程，衛生局的老師會(huì )根據你的實(shí)驗室布局提出自己的意見(jiàn)，我們實(shí)驗室是經(jīng)過(guò)設施改造后最終達標的，每年均會(huì )進(jìn)行一次突擊的飛行檢查（不會(huì )提前一天，比如9點(diǎn)打電話(huà)10點(diǎn)就到現場(chǎng)了），我個(gè)人覺(jué)得管理力度還是非常夠的，能很好的督促我們嚴格的管理我們的生物安全實(shí)驗室。
那對于使用菌株的生物安全實(shí)驗室，安全問(wèn)題非常非常的重要，菌株的無(wú)故外泄、人員實(shí)驗室的溢撒事件等等都是一系列需要關(guān)注的問(wèn)題。我們在陽(yáng)性室設置門(mén)禁，避免無(wú)關(guān)人員進(jìn)入；在設備方面我們盡量做到陽(yáng)性室專(zhuān)用，如菌株保藏專(zhuān)用冰箱、菌株專(zhuān)用培養箱、菌株專(zhuān)用滅菌器，這些全部設置在生物安全實(shí)驗室內部；對于生物安全的管理設有專(zhuān)門(mén)的生物安全委員會(huì )，有處理各種生物安全事件的應急預案，每年都會(huì )進(jìn)行應急演練并拍照和錄像，每年會(huì )對整個(gè)生物安全實(shí)驗室進(jìn)行整體評估出具評估報告，并且每年對生物安全實(shí)驗室的人員進(jìn)行生物安全培訓，讓每一位參與菌株實(shí)驗的人員都明白其中的重要性。
菌株的事情可大可小，我們在認識這種活體小東西的同時(shí)必須盡可能的了解它們的特性，讓它們?yōu)槲覀兯�，并盡量避免安全事故的發(fā)生（SARS就是從實(shí)驗室出去的。。。），所以我們必須特別小心謹慎的操作它們，最重要的還是這點(diǎn)——保護好自己�。�！
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