IMViC與硫化氫試驗

  (一)目的要求
了解IMViC與硫化氫反應的原理及其在腸道菌鑒定中的意義和方法。
(二)基本原理
IMViC是吲哚(indol test)、甲基紅(methy1 red test)、伏一普(Voges-Prokauer test)和檸檬酸鹽(citrate test)四個(gè)試驗的縮寫(xiě)，I是在英文中為了發(fā)音方便而加上的。這四個(gè)試驗主要是用來(lái)快速鑒別大腸桿菌和產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes)，多用于水的細菌學(xué)檢查。大腸桿菌雖非致病菌，但在飲用水中若超過(guò)一定數量，則表示受糞便污染。產(chǎn)氣腸桿菌也廣泛存在于自然界中，因此檢查水時(shí)要將兩者分開(kāi)。
硫化氫試驗也是檢查腸道桿菌的生化試驗。
吲哚試驗是用來(lái)檢測吲哚的產(chǎn)生。有些細菌能產(chǎn)生色氨酸酶，分解蛋白胨中的色氨酸產(chǎn)生吲哚和丙酮酸。吲哚與對二甲基氨基苯甲醛結合，形成紅色的玫瑰吲哚。但并非所有微生物都具有分解色氨酸產(chǎn)生吲哚的能力，因此吲哚試驗可以作為一個(gè)生物化學(xué)檢測的指標。
色氨酸水解反應：
吲哚與對二甲基氨基苯甲醛反應： 
大腸桿菌吲哚反應陽(yáng)性，產(chǎn)氣腸桿菌為陰性。
甲基紅試驗是用來(lái)檢測由葡萄糖產(chǎn)生的有機酸，如甲酸、乙酸、乳酸等。當細菌代謝糖產(chǎn)生酸時(shí)，培養基就會(huì )變酸，使加入培養基的甲基紅指示劑由橘黃色(pH6.3)變?yōu)榧t色(pH4.2)，即甲基紅反應。盡管所有的腸道微生物都能發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)生有機酸，但這個(gè)試驗在區分大腸桿菌和產(chǎn)氣腸桿菌上仍然是有價(jià)值的。這兩個(gè)細菌在培養的早期均產(chǎn)生有機酸，但大腸桿菌在培養后期仍能維持酸性pH4，而產(chǎn)氣腸桿菌則轉化有機酸為非酸性末端產(chǎn)物，如乙醇、丙酮酸等，使pH升至大約6。因此大腸桿菌為陽(yáng)性反應，產(chǎn)氣腸桿菌為陰性反應。
伏-普試驗是用來(lái)測定某些細菌利用葡萄糖產(chǎn)生非酸性或中性末端產(chǎn)物的能力，如丙酮酸。丙酮酸進(jìn)行縮合、脫羧生成乙酰甲基甲醇，此化合物在堿性條件下能被空氣中的氧氣氧化成二乙酰。二乙酰與蛋白胨中精氨酸的胍基作用，生成紅色化合物，即伏-普反應陽(yáng)性；不產(chǎn)生紅色化合物者為陰性反應。有時(shí)為了使反應更為明顯，可加入少量含胍基的化合物，如肌酸等。
其化學(xué)反應過(guò)程如下：
檸檬酸鹽試驗是用來(lái)檢測檸檬酸鹽是否被利用。有些細菌能夠利用檸檬酸鈉作為碳源，如產(chǎn)氣腸桿菌；而另一些細菌則不能利用檸檬酸鹽，如大腸桿菌。細菌在分解檸檬酸鹽及培養基中的磷酸銨后，產(chǎn)生堿性化合物，使培養基的pH升高，當加入1%溴麝香草酚藍指示劑時(shí)，培養基就會(huì )由綠色變?yōu)樯钏{色。溴麝香草酚藍的指示范圍為：pH小于6.0時(shí)呈黃色，pH在6.0~7.0時(shí)為綠色，pH大于7.6時(shí)呈藍色。
硫化氫試驗是檢測硫化氫的產(chǎn)生，也是用于腸道細菌檢查的常用生化試驗。有些細菌能分解含硫的有機物，如胱氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸等產(chǎn)生硫化氫，硫化氫一遇培養基中的鉛鹽或鐵鹽等，就形成黑色的硫化鉛或硫化鐵沉淀物。
以半胱氨酸為例，其化學(xué)反應過(guò)程如下：
CH2SHCHNH2COOH+H2O→CH3COCOOH+H2S↑+NH3↑
H2S+Pb（CH3COO）2→PbS↓+2CH3COOH
                             （黑色）
大腸桿菌為陰性，產(chǎn)氣腸桿菌為陽(yáng)性。
(三)器材
l．菌種   大腸桿菌，產(chǎn)氣腸桿菌。
2．培養基   蛋白胨水培養基，葡萄糖蛋白胨水培養基，檸檬酸鹽斜面培養基，醋酸鉛培養基。
在配制檸檬酸鹽斜面培養基時(shí)，其pH不要偏高，以淺綠色為宜，吲哚試驗中用的蛋白胨水培養基中宜選用色氨酸含量高的蛋白胨，如用胰蛋白酶水解酪素得到的蛋白胨較好。
3．溶液或試劑   甲基紅指示劑，40%KOH，5%α-萘蔡酚，乙醚，吲哚試劑等。
(四)操作步驟
l．接種與培養
(1)用接種針將大腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌分別穿刺接入2支醋酸鉛培養基中(硫化氫試驗)，置37C培養48h。
(2)將上述二菌分別接種于2支蛋白胨水培養基(吲哚試驗),2支葡萄糖蛋白胨水培養基(甲基紅試驗和伏-普試驗)，2支檸檬酸鹽斜面培養基和2支醋酸鉛培養基中，置37℃培養2d。
2．結果觀(guān)察
(1)硫化氫試驗  培養48h后觀(guān)察黑色硫化鉛的產(chǎn)生。
(2)吲哚試驗  于培養2d后的蛋白胨水培養基內加3~4滴乙醚，搖動(dòng)數次，靜置1~3min，待乙醚上升后，沿試管壁徐徐加入2滴吲哚試劑，在乙醚和培養物之間產(chǎn)生紅色環(huán)狀物為陽(yáng)性反應。
配制蛋白胨水培養基，所用的蛋白胨最好用含色氨酸高的，如用胰蛋白酶水解酪素得到的蛋白胨中色氨酸含量較高。
(3)甲基紅試驗  培養2d后，將l支葡萄糖蛋白胨水培養物內加入甲基紅試劑2滴，培養基變?yōu)榧t色者為陽(yáng)性，變黃色者為陰性。
注意甲基紅試劑不要加得太多，以免出現假陽(yáng)性反應。
(4)伏-普試驗培養2d后，將另1支葡萄糖蛋白胨水培養物內加入5~10滴40%KOH，然后加入等量的5%α-萘酚溶液，用力振蕩，再放入37℃溫箱中保溫15~30min，以加快反應速度。若培養物呈紅色者，為伏-普反應陽(yáng)性。
(5)檸檬酸鹽試驗培養48h后觀(guān)察檸檬酸鹽敘面培養基上有無(wú)細菌生長(cháng)和是否變色。藍色為陽(yáng)性，綠色為陰性。
五、實(shí)驗報告
1．結果
將實(shí)驗結果填入下表�！�+”表示陽(yáng)性反應，“-”表示陰性反應。
2．思考題
(1)討論IMViC試驗在醫學(xué)檢驗上的意義。
(2)解釋在細菌培養中吲哚檢測的化學(xué)原理，為什么在這個(gè)試驗中用吲哚的存在作為色氨酸活性的指示劑，而不用丙酮酸？
(3)為什么大腸桿菌是甲基紅反應陽(yáng)性，而產(chǎn)氣腸桿菌為陰性？這個(gè)試驗與伏一普試驗最初底物與最終產(chǎn)物有何異同處？為什么會(huì )出現不同？
(4)說(shuō)明在硫化氫試驗中，醋酸鉛的作用，可以用哪種化合物代替醋酸鉛？
   

 

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