LGG益生菌的檢測

1適用范圍：適用于定量分析LGG純菌種及LGG乳制品中的LGG菌數量。

2定義：LGG是一種鼠李糖乳桿菌菌株(ATCC 53103)，革蘭氏陽(yáng)性，過(guò)氧化物酶陰性，棒狀，鏈形，不發(fā)酵乳糖，對萬(wàn)古霉素有抗性。

3原理：樣品經(jīng)稀釋劑稀釋后均質(zhì)，然后按10倍的稀釋倍數接種到選擇性瓊脂培養基中，厭氧培養，計數所有的菌落，結果以cuf/g計。

注：培養過(guò)程中，所有萬(wàn)古霉素抗性的菌株都會(huì )生長(cháng)（比如所有的鼠李糖乳桿菌，干酪乳桿菌，胚芽乳桿菌等）。但是，由于LGG不發(fā)酵乳糖，所以可以很容易地區分開(kāi)來(lái)。進(jìn)一步分析鑒定則可采用基因的方法。

4儀器和玻璃器皿

只要規格可以滿(mǎn)足要求，采用一次性或可重復使用的儀器均可。除了微生物實(shí)驗室所常用的儀器外，下列儀器是必需的：

烘箱；    高壓殺菌鍋；   培養箱（37℃±1℃）；      水�。�44-47℃）；

混合器（Peristaltic-type）；帶有無(wú)菌塑料袋；        天平。

5培養基和試劑

5.1 稀釋液準備

蛋白棟1.0g；        氯化鈉8.5g；      去離子水1000mL。

若需要，可緩慢加熱至完全溶解。將溶液分至一些瓶子中，然后在高壓殺菌鍋中進(jìn)行殺菌（121℃±1℃，15分鐘）。殺菌后，溶液pH7.0±0.2。

每個(gè)瓶子均可在常溫下貯存半年。

5.2 培養基

5.2.1 MRS瓊脂培養基：適用于純LGG菌種檢測。高壓殺菌后pH6.4±0.2,4-6℃條件下可貯存6個(gè)月。

5.2.2 MRS-萬(wàn)古霉素瓊脂培養基（MRS-V）：適用于LGG菌種與普通酸奶菌種混合后的檢測。萬(wàn)古霉素50mg/L, 可以在高壓殺菌前加入，也可以作為無(wú)菌濾液加入瓊脂中。

5.2.3 MRSL肉湯培養基（檢測乳糖發(fā)酵特性）

分別溶解于5-10mL乙醇中，然后加入肉湯中。取5mL試樣，高壓殺菌（121℃±1℃，15分鐘）后作測試用。殺菌后，溶液pH7.2±0.2。

6步驟

6.1 樣品制備

樣品制備前，先放置于室溫下1-2小時(shí)，以使其溫度與室溫相同。稱(chēng)取10g樣品于無(wú)菌塑料袋中，加入90ml無(wú)菌蛋白胨-氯化鈉水溶液。將塑料袋放入混合器中混合60秒，以確保懸浮液均勻一致。這是第一個(gè)稀釋10倍的樣液，該溶液必須繼續按10倍的倍數進(jìn)行稀釋?zhuān)�且必須�?5分鐘內將各樣液接種到培養皿中。

6.2 在選擇性瓊脂培養基中接種

選擇合適的瓊脂培養基：純菌種用MRS瓊脂培養基，混合菌種用MRS-萬(wàn)古霉素瓊脂培養基。取1mL（傾倒法，即Pour-plate method）或0.1mL（涂抹法，即spread-plate method）每一稀釋度的樣液分別接種到兩個(gè)培養皿中，瓊脂的溫度應為44-47℃，然后于厭氧條件下進(jìn)行培養（37±1℃，72±6小時(shí)）。

6.3 菌落計數

計數那些LGG菌落在10-300之間的培養皿。LGG菌落特征：光滑、大、白色、圓形或橢圓形、邊緣清晰。

6.4 確認實(shí)驗

為了進(jìn)一步確認菌落是否為L(cháng)GG，可從菌落中挑取一些純菌種，進(jìn)行顯微鏡觀(guān)察和乳糖發(fā)酵實(shí)驗（MRSL肉湯）。做乳糖發(fā)酵實(shí)驗時(shí)，將挑取的純菌種接種到肉湯培養基后，有氧培養（37±1℃，1-2天）。由于LGG不發(fā)酵乳糖，故肉湯應是紫色的（未變色）。而若是能夠利用乳糖的微生物，則肉湯變?yōu)辄S色。實(shí)驗時(shí)，利用純LGG菌種和任一能夠利用乳糖的其它菌種進(jìn)行對照實(shí)驗。

7結果          以每克樣品中LGG的菌落數表示，即cfu/g。

8注意事項：

1）、制備培養基，滅菌前可將萬(wàn)古霉素加到MRS-A培養基中混均，按照培養基標簽上使用說(shuō)明進(jìn)行滅菌；

2）、檢樣前需將樣品在室溫下放置1-2小時(shí)，使其溫度與室溫相同，稱(chēng)取樣品時(shí)應將包含LGG益生菌的部分接入稀釋液中，混勻進(jìn)行接種；

3）、根據樣品特性，接種稀釋倍數可選擇10-4和10-5，每個(gè)稀釋度分別接種兩個(gè)平皿；

4）、樣品制備完畢，將各樣液接種到培養皿，傾倒溫度為44-47℃培養基，整個(gè)操作過(guò)程必須在15分鐘內完成，同時(shí)做瓊脂空白試驗；

5）、待瓊脂凝固后，翻轉平皿放入厭氧罐，再放入厭氧測試條，然后放入產(chǎn)氣袋，產(chǎn)氣袋放入后應立即將蓋蓋嚴，避免產(chǎn)氣袋在空氣中暴露時(shí)間過(guò)長(cháng)；

6）、檢樣放入厭氧罐后在規定的培養條件下進(jìn)行培養，并隨時(shí)觀(guān)察厭氧測試條顏色變化情況（無(wú)氧為白色，有氧時(shí)為粉色），保證培養條件完全達到無(wú)氧狀態(tài)；放入測試條時(shí)注意不要靠壁，使其處于自然狀態(tài)。（一般在放入培養箱后3-5小時(shí)后觀(guān)察，如測試條顏色發(fā)生變化，應再放入產(chǎn)氣袋重新進(jìn)行測試）。

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