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方法一：基準法—6.5℃，培養10天（仲裁法）（IDF標準101A：1991）
1 適用范圍：適用于原奶和巴氏殺菌奶的檢驗。
2 方法提要
2.1 準備好倒有培養基和定量稀釋適當倍數的被測樣品的培養皿。。
2.2 將培養皿在6.5℃條件下培養10天。
2.3 根據培養皿中的菌落數計算出每毫升樣品中的菌落數，選擇菌落數比較恰當的稀釋倍數比較得當的培養皿進(jìn)行菌落計數。
3試劑
3.1 稀釋液
生理鹽水：0.85％的氯化鈉水溶液，滅菌。
3.2 培養基
平板計數瓊脂23.5g+脫脂奶粉1g，溶于1000mL水中。必要時(shí)用濾紙過(guò)濾。調節pH值為6.9±0.1。將培養基分裝倒入三角瓶中，每瓶100—150mL。在121±1℃下滅菌15min，如果培養基馬上要用，用水浴鍋冷卻到46±1℃。如果不是，則為了不耽誤培養基的使用，在實(shí)驗開(kāi)始前，將培養基放入沸騰水浴中使其完全熔化，然后再放入水浴中冷卻到46±1℃。
注：其中脫脂粉應該不含有抑菌劑。
4 儀器及玻璃器皿
微生物實(shí)驗室常用儀器，制備和稀釋樣品所用儀器以及：
4.1 培養箱，可以調節并保持到6.5±0.5℃
4.2 pH計，帶溫度補償，精度為0.1
4.3 水浴，可以保持到46±1℃
4.4 三角瓶，250—300mL，帶合適的塞子。
4.5 吸管，用嘴吸的吸管要用脫脂棉或纖維素塞緊。
4.6 培養皿，玻璃或塑料的，直徑在90—100mm
5.操作步驟
5.1樣品的稀釋及培養
5.1.1 以無(wú)菌操作，將25mL樣品注入含有225mL滅菌生理鹽水的三角瓶?jì)�，充分混勻，制�?：10的稀釋液。
5.1.2 用1mL滅菌吸管吸取1：10的稀釋液1mL，沿管壁徐徐注入含有9mL滅菌生理鹽水的試管內，充分混勻，制成1：100的稀釋液。
5.1.3 另取1mL滅菌吸管，按上項操作順序，作10倍遞增稀釋液，如此每遞增稀釋一次，即換用1支吸管。
5.1.4 根據對樣品污染情況的估計，選擇2—3個(gè)適宜稀釋度，分別在作10倍遞增稀釋的同時(shí)，即以吸取該稀釋度的吸管移取1mL稀釋液于滅菌平皿內，每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平皿。
注：其他稀釋方法可以使用，例如第一步稀釋可以是10mL檢測樣品注入到90mL稀釋液中，或11mL檢測樣品注入到99mL稀釋液中。當樣品和稀釋液用量更大，方法的精密度和準確度就更高。
5.1.5稀釋液移入平皿后，應及時(shí)將涼至46℃的培養基（可放置于46±1℃水浴保溫）注入平皿約15mL，并轉動(dòng)平皿使混合均勻。同時(shí)將培養基傾入空的滅菌平皿內作空白對照。
注：從稀釋樣品到傾倒培養基，整個(gè)操作過(guò)程不應超過(guò)15min。
5.1.6 待培養基凝固，翻轉平板，放入6.5℃培養箱內培養10天。
注：每疊皿不應超過(guò)6個(gè)，每疊皿之間以及與培養箱的壁之間應保持一定的間隙。
5.2 菌落計數方法
對平皿進(jìn)行菌落計數時(shí)，應在柔和的光線(xiàn)下計數。為了便于計數，可使用適當的放大鏡和（或）菌落計數器。以防極小的菌落遺漏，以及避免將平皿中雜質(zhì)顆粒進(jìn)行計數。仔細檢查可疑的物質(zhì)，如需要可使用更高倍數的放大鏡，以區別菌落和外來(lái)物質(zhì)。
5.3 菌落計數的報告
5.3.1 平板菌落數的選擇
平板有較大片狀菌落生長(cháng)時(shí)，則不宜采用，而應以無(wú)片狀菌落生長(cháng)的平板作為該稀釋度的菌落數，若片狀菌落不到平板的一半，而另一半菌落分布又很均勻，即可計算半個(gè)平板后乘2以代表全皿菌落數。平板內若有鏈狀菌落生長(cháng)時(shí)（菌落之間無(wú)明顯界限），若僅有一條鏈，可視為一個(gè)菌落；如果有不同來(lái)源的幾條鏈，則應將每條鏈作為一個(gè)菌落計。
5.3.2 稀釋度的選擇及報告
5.3.2.1 選取菌落數在10-300之間的培養皿作為計數的測定標準。
5.3.2.2 若有兩個(gè)稀釋度，其生長(cháng)的菌落數在10-300之間，則按下面的方法計數。
計算每mL牛奶中微生物的個(gè)數N，用以下的公式：
∑c
N =
（n1+0.1n2）d
這里∑c： 是所有皿上菌落數的總和。
n1： 是第一個(gè)稀釋度培養皿的個(gè)數。
n2： 是第二個(gè)稀釋度培養皿的個(gè)數。
d： 是與第一個(gè)稀釋液相對應的稀釋因子
結果保留兩位有效數字，后面的數字以四舍五入計算。當第三位數是5時(shí)，看其左邊的數是奇偶數進(jìn)行數字取舍；如28500進(jìn)行數字取舍為28000，11500為12000。
結果以科學(xué)計數法表示。
舉例
微生物計數給出以下的結果（包括兩個(gè)帶蓋培養皿）：
在第一個(gè)稀釋度（10E-2）：168和215個(gè)菌
在第二個(gè)稀釋度（10E-3）：14和25個(gè)菌落
∑c 168+215+14+25 422
N = = = =19182
（n1+0.1n2）d [2+（0.1*2）]*10-2 0.022
根據上面所說(shuō)結果進(jìn)行取舍為19000，結果為1.9×104個(gè)/ml。
注：如果有兩個(gè)以上可以計數的稀釋度，公式應修改為用多個(gè)稀釋度進(jìn)行計算。如為三個(gè)稀釋度，由下面的公式可計算出每毫升中微生物的數量。
∑c
N =
（n1+0.1n2+0.01n3）d
5.3.2.3 如果菌落數均小于10，則按稀釋度最低的平均菌落數乘以稀釋倍數，報告每毫升牛奶菌落的估計數。
5.3.2.4 如果菌落數均超過(guò)300，則按稀釋度最高的平均菌落數乘以稀釋倍數，報告每毫升牛奶菌落的估計數。
方法二：快速法—21℃，培養25ｈ（IDF標準132A）
1 范圍
本標準描述的是通過(guò)21℃時(shí)快速菌落計數技術(shù)進(jìn)行嗜冷菌菌數估算的方法。
此方法用于原奶和巴氏殺菌奶的檢驗—當需要很快的得到嗜冷菌估算值的時(shí)候。
2 方法提要
2.1 準備好倒有培養基和定量稀釋適當倍數的被測樣品的培養皿。
2.2 將培養皿在21℃條件下培養25h。
2.3 根據培養皿中的菌落數計算出每毫升樣品中的菌落數，選擇菌落數比較恰當的稀釋倍數比較得當的培養皿進(jìn)行菌落計數。
3 試劑
3.1 稀釋液
生理鹽水：0.85％的氯化鈉水溶液，滅菌。
3.2 培養基
平板計數瓊脂23.5g+脫脂奶粉1g，溶于1000mL水中。必要時(shí)用濾紙過(guò)濾。調節pH值為6.9±0.1。將培養基分裝倒入三角瓶中，每瓶100—150mL。在121±1℃下滅菌15min，如果培養基馬上要用，用水浴鍋冷卻到46±1℃。如果不是，則為了不耽誤培養基的使用，在實(shí)驗開(kāi)始前，將培養基放入沸騰水浴中使其完全熔化，然后再放入水浴中冷卻到46±1℃。
注：其中脫脂粉應該不含有抑菌劑。
4 儀器及玻璃器皿
微生物實(shí)驗室常用儀器，制備和稀釋樣品所用儀器以及：
4.1 培養箱，可以調節并保持到21±1℃
4.2 pH計，帶溫度補償，精度為0.1
4.3 水浴，可以保持到46±1℃
4.4 三角瓶，250—300mL，帶合適的塞子。
4.5 吸管，用嘴吸的吸管要用脫脂棉或纖維素塞緊。
4.6培養皿，玻璃或塑料的，直徑在90—100mm
5. 操作步驟
5.1樣品的稀釋及培養
稀釋步驟同方法一中5.1.1—5.1.5。
5.1.6待培養基凝固翻轉平板，放入21℃培養箱內培養25h。
注：每疊皿不應超過(guò)6個(gè)，每疊皿之間以及與培養箱的壁應保持一定的間隙。
5.2菌落計數方法
同方法一中5.2。
5.3 菌落計數的報告
同方法一中5.3。
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