大分子物質(zhì)的水解試驗

 (一)目的要求
1．證明不同微生物對各種有機大分子的水解能力不同，從而說(shuō)明不同微生物有著(zhù)不同的酶系統。
2．掌握進(jìn)行微生物大分子水解試驗的原理和方法。
(二)基本原理
微生物對大分子的淀粉、蛋白質(zhì)和脂肪不能直接利用，必須靠產(chǎn)生的胞外酶將大分子物質(zhì)分解才能被微生物吸收利用。胞外酶主要為水解酶，通過(guò)加水裂解大的物質(zhì)為較小的化合物，使其能被運輸至細胞內。如淀粉酶水解淀粉為小分子的糊精、雙糖和單糖；脂肪酶水解脂肪為甘油和脂肪酸；蛋白酶水解蛋白質(zhì)為氨基酸等。這些過(guò)程均可通過(guò)觀(guān)察細菌菌落周?chē)�的物質(zhì)變化來(lái)證實(shí)：淀粉遇碘液會(huì )產(chǎn)生藍色，但細菌水解淀粉的區域，用碘測定不再產(chǎn)生藍色，表明細菌產(chǎn)生淀粉酶。脂肪水解后產(chǎn)生脂肪酸可改變培養基的pH，使pH降低，加入培養基的中性紅指示劑會(huì )使培養基從淡紅色變?yōu)樯罴t色，說(shuō)明胞外存在著(zhù)脂肪酶。
微生物可以利用各種蛋白質(zhì)和氨基酸作為氮源外，當缺乏糖類(lèi)物質(zhì)時(shí)，亦可用它們作為碳源和能源。明膠是由膠原蛋白經(jīng)水解產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，在25℃以下可維持凝膠狀態(tài)，以固體形式存在。而在25℃以上明膠就會(huì )液化。有些微生物可產(chǎn)生一種稱(chēng)作明膠酶的胞外酶，水解這種蛋白質(zhì)，而使明膠液化，甚至在4℃仍能保持液化狀態(tài)。
還有些微生物能水解牛奶中的蛋白質(zhì)酪素，酪素的水解可用石蕊牛奶來(lái)檢測。石蕊培養基由脫脂牛奶和石蕊組成，是昏濁的藍色。酪素水解成氨基酸和肽后，培養基就會(huì )變得透明。石蕊牛奶也常被用來(lái)檢測乳糖發(fā)酵，因為在酸存在下，石蕊會(huì )轉變?yōu)榉奂t色，而過(guò)量的酸可引起牛奶的固化(凝乳形成)。氨基酸的分解會(huì )引起堿性反應，使石蕊變?yōu)樽仙�。此外，某些細菌能還原石蕊，使試管底部變?yōu)榘咨��?br>尿素是由大多數哺乳動(dòng)物消化蛋白質(zhì)后被分泌在尿中的廢物。尿素酶能分解尿素釋放出氨，這是一個(gè)分辨細菌很有用的診斷實(shí)驗。盡管許多微生物都可以產(chǎn)生尿素酶，但它們利用尿素的速度比變形桿菌屬(Proteus)的細菌要慢，因此尿素酶試驗被用來(lái)從其他非發(fā)酵乳糖的腸道微生物中快速區分這個(gè)屬的成員。尿素瓊脂含有蛋白胨，葡萄糖，尿素和酚紅。酚紅在pH6.8時(shí)為黃色，而在培養過(guò)程中，產(chǎn)生尿素酶的細菌將分解尿素產(chǎn)生氨，使培養基的pH升高，在pH升至8.4時(shí)，指示劑就轉變?yōu)樯罘奂t色。
(三)器材
1．菌種   枯草芽胞桿菌，大腸桿菌，金黃色葡萄球菌，銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，普通變形桿菌。
2．培養基  固體油脂培養基，固體淀粉培養基，明膠培養基試管，石蕊牛奶試管，尿素瓊脂試管。
3．溶液或試劑   革蘭氏染色用盧戈氏碘液(Lugol’s iodine solution)。
4．儀器或其他用具   無(wú)菌平板，無(wú)菌試管，接種環(huán)，接種針，試管架。
(四)操作步驟
l．淀粉水解試驗
(1)將固體淀粉培養基溶化后冷卻至50℃左右，無(wú)菌操作制成平板。
(2)用記號筆在平板底部劃成四部分。
(3)將枯草芽孢桿菌，大腸桿菌，金黃色葡萄球菌，銅綠假單胞菌分別在不同的部分劃線(xiàn)接種，在平板的反面分別在四部分寫(xiě)上菌名。
(4)將平板倒置在37℃溫箱中培養24h。
(5)觀(guān)察各種細菌的生長(cháng)情況，將平板打開(kāi)蓋子，滴入少量Lugol’s碘液于平皿中，輕輕旋轉平板，使碘液均勻鋪滿(mǎn)整個(gè)平板。
如菌苔周?chē)�出現無(wú)色透明圈，說(shuō)明淀粉己被水解，為陽(yáng)性。透明圈的大小可初步判斷該菌水解淀粉能力的強弱，即產(chǎn)生胞外淀粉酶活力的高低。
2．油脂水解試驗
(1)將溶化的固體油脂培養基冷卻至50℃左右時(shí)，充分搖蕩，使油脂均勻分布。無(wú)菌操作倒入平板，待凝。
(2)用記號筆在平板底部劃成四部分，分別標上菌名。
(3)將上述四種菌分別用無(wú)菌操作劃+字接種于平板的相對應部分的中心。
(4)將平板倒置，于37℃溫箱中培養24h。
(5)取出平板，觀(guān)察菌苔顏色，如出現紅色斑點(diǎn)說(shuō)明脂肪水解，為陽(yáng)性反應。                        
3．明膠水解試驗
(1)取三支明膠培養基試管，用記號筆標明各管欲接種的菌名。
(2)用接種針?lè )謩e穿刺接種(見(jiàn)圖3—4B)枯草芽抱桿菌，大腸桿菌，金黃色葡萄球菌。
(3)將接種后的試管置20℃中，培養2～5d。
(4)觀(guān)察明膠液化情況(圖16-1)。
4．石蕊牛奶試驗
(1)取兩支石蕊牛奶培養基試管，用記號筆標明各管欲接種的菌名。
(2)分別接種普通變形桿菌和金黃色葡萄球菌。
(3)將接種后的試管置35℃中，培養24～48h。
(4)觀(guān)察培養基顏色變化。石蕊在酸性條件下為粉紅色，堿性條件下為紫色，而被還原時(shí)為白色。
5．尿素試驗
(1)取兩支尿素培養基斜面試管，用記號筆標明各管欲接種的菌名。
(2)分別接種普通變形桿菌和金黃色葡萄球菌。
(3)將接種后的試管置35℃中，培養24~48h。
(4)觀(guān)察培養基顏色變化。尿素酶存在時(shí)為紅色，無(wú)尿素酶時(shí)應為黃色。
(五)實(shí)驗報告
1．結果
將結果填入下表，“+”表示陽(yáng)性，“-”表示陰性。
2．思考題
(1)你怎樣解釋淀粉酶是胞外酶而非胞內酶？
(2)不利用碘液，你怎樣證明淀粉水解的存在？
(3)接種后的明膠試管可以在35℃培養，在培養后你必須做什么才能證明水解的存在？
(4)解釋在石蕊牛奶中的石蕊為什么能起到氧化還原指示劑的作用？
(5)為什么尿素試驗可用于鑒定Proteus細菌？
  
   

 

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