PFGE概述

PFGE的作用

 PFGE是目前分子生物學(xué)技術(shù)在準確性，特異性，分辨率，重復性最好的方法之一。

 染色體DNA經(jīng)過(guò)特異性限制性?xún)惹忻傅拿盖凶饔�，可以產(chǎn)生多條10-800kb的酶切片段，通過(guò)片斷的多少和大小來(lái)比較細菌的同源性。

 根據同源性來(lái)推斷傳染來(lái)源和途徑；為更好的作好傳染病的防治起到一定的作用。

PFGE方法步驟

一、膠塊的制備

1、刮取適量新培養的細菌均勻渾濁于含有1ml細胞懸濁液的eppendorf中，調整OD值至4.0。

2、取400 μl CSB于eppendorf管中置37度水浴中孵育5分鐘。

3、在水浴管中加于20 μl蛋白酶K（20mg/ml）使其終濃度為0，5mg/ml。

4、在eppendorf管中加入400 μl的1%Seakem Gold（1%SDS），用槍頭輕輕混勻。將混合物加入模具，避免產(chǎn)生氣泡，室溫下凝固10-15分鐘。

二、細胞的裂解

1、每管中加入5ml蛋白酶K/CLB混合液。

2、將以制好的膠塊加入管中，使其在液面下，將管子放在54 ℃水浴搖床中孵育2小時(shí)，轉速約170轉/分鐘。

三、洗膠塊

1、從水浴搖床中取出管子，倒掉CLB，每管加入15ml預熱的純水，放回50 ℃水浴搖床中，搖15分鐘。

2、倒掉水，用純水再洗一次。

3、倒掉水，加入15ml預熱的TE，放回50 ℃水浴搖床中，搖15分鐘。

4、倒掉TE，用TE重復洗4次，每次15分鐘。

5、倒掉TE ，加入10mlTE，放在4 ℃冰箱保存備用。

四、酶切

1、小心取出TE中的膠塊放干凈的培養皿上。用刀片切2mm寬的膠塊放入含200μl稀釋液的eppendorf管中。放37 ℃水浴中孵育10-15分鐘。

2、槍頭吸出稀釋液，避免損傷膠塊。加入200μl酶切液，并確保膠塊在液面下。放37 ℃水浴中孵育至少2小時(shí)。

五、加樣

1、制膠。

2、 從37 ℃水浴中取出管子，平衡到室溫。吸出酶切液，加入200μl0.5 ☓TBE平衡。

3、用小鏟將膠塊加入加樣孔中。并用溶化的膠封閉加樣孔。

六、電泳

1、電泳槽中加入2.2L 0.5 ☓TBE，蓋好蓋子。

2、打開(kāi)主機和泵的開(kāi)關(guān)。

3、打開(kāi)冷凝機，確保溫度在14℃。

4、把膠放入電泳槽，設置電泳參數。

5、關(guān)機。

七、分析結果

讀膠，獲取圖像。

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