大腸桿菌生長(cháng)曲線(xiàn)的測定

 (一)目的要求
1．通過(guò)細菌數量的測量了解大腸桿菌的生物特征和規律，繪制生長(cháng)線(xiàn)。
2．復習光電比濁法測量細菌數量的方法。
(二)基本原理
大多數細菌的繁殖速率很快，在合適的條件下，一定時(shí)期的大腸桿菌細胞每20min分裂一次。將一定量的細菌轉入新鮮液體培養基中，在適宜的條件下培養細胞要經(jīng)歷延遲期，對數期、穩定期和衰亡期四個(gè)階段。以培養時(shí)間為橫坐標，以細菌數目的對數或生長(cháng)速率為縱坐標作圖所繪制的曲線(xiàn)稱(chēng)為該細菌的生長(cháng)曲線(xiàn)。不同的細菌在相同的培養條件下其生長(cháng)曲線(xiàn)不同，同樣的細菌在不同的培養條件下所繪制的生長(cháng)曲線(xiàn)也不相同。測定細菌的生長(cháng)曲線(xiàn)，了解其生長(cháng)繁殖規律，這對人們根據不同的需要，有效地利用和控制細菌的生長(cháng)具有重要意義。
用于測定細菌細胞數量的方法已在上述實(shí)驗作了介紹。本實(shí)驗用分光光度計(spectrophotometer)進(jìn)行光電比濁測定不同培養時(shí)間細菌懸浮液的OD值，繪制生長(cháng)曲線(xiàn)。也可以直接用試管或帶有測定管的三角瓶(圖15-5)測定“klett units”值的光度計。如圖15—6所示，只要接種1支試管或1個(gè)帶測定管的三角瓶，在不同的培養時(shí)間(橫坐標)取樣測定，以測得的klett units為縱坐標，便可很方便地繪制出細菌的生長(cháng)曲線(xiàn)。如果需要，可根據公式1 klett units=OD/0.002換算出所測菌懸液的OD值。
(三)器材
1．菌種    大腸桿菌
2．培養基    LB液體培養基70ml，分裝2支大試管(5ml/支)，剩余60ml裝入250ml的三角瓶。
3．儀器或其他用具    722型分光光度計，水浴振蕩搖床，無(wú)菌試管，無(wú)菌吸管等。
(四)操作步驟
1．標記
取11支無(wú)菌大試管，用記號筆分別標明培養時(shí)間，即0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16和20h。
2．接種
分別用5ml無(wú)菌吸管吸取2.5ml大腸桿菌過(guò)夜培養液(培養10~12h)轉入盛有50ml  LB液的三角瓶?jì)�，混合均勻后分別取5ml混合液放入上述標記的11支無(wú)菌大試管中。
3．培養
將已接種的試管置搖床37℃振蕩培養(振蕩頻率250r/min)，分別培養0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16和20h，將標有相應時(shí)間的試管取出，立即放冰箱中貯存，最后一同比濁測定其光密度值。
4．比濁測定
用未接種的LB液體培養基作空白對照，選用600nm波長(cháng)進(jìn)行光電比濁測定。從早取出的培養液開(kāi)始依次測定，對細胞密度大的培養液用LB液體培養基適當稀釋后測定，使其光密度值在0.1~0.65之內(測定OD值前，將待測定的培養液振蕩，使細胞均勻分布)。
本操作步驟也可用簡(jiǎn)便的方法代替：
1．用1ml無(wú)菌吸管取0.25ml大腸桿菌過(guò)夜培養液轉入盛有3~5ml  LB液的試管中、混勻后將試管直接插入分光光度計的比色糟中，比色糟上方用自制的暗盒將試管及比色暗室全部罩上，形成一個(gè)大的暗環(huán)境，另以1支盛有LB液但沒(méi)有接種的試管調零點(diǎn)，測定樣品中培養0h的OD值。測定完畢后，取出試管置37℃繼續振蕩培養。
2．分別在培養0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16和20h，取出培養物試管按上述方法測定OD值。該方法準確度高、操作簡(jiǎn)便。但須注意的是使用的2支試管要很干凈，其透光程度愈接近，測定的準確度愈高。
(五)實(shí)驗報告
1．結果
(1)將測定的OD600值填入下表：
(2)繪制大腸桿菌的生長(cháng)曲線(xiàn)
2．思考題
(1)如果用活菌計數法制作生長(cháng)曲線(xiàn)，你認為會(huì )有什么不同？?jì)烧吒饔惺裁磧?yōu)缺點(diǎn)？
(2)細菌生長(cháng)繁殖所經(jīng)歷的四個(gè)時(shí)期中，哪個(gè)時(shí)期其代時(shí)最短？若細胞密度為103/ml，培養4.5h后，其密度高達2×108/ml，計計算出其代時(shí)。
(3)次生代謝產(chǎn)物的大量積累在哪個(gè)時(shí)期？根據細菌生長(cháng)繁殖的規律，采用哪些措施可使次生代謝產(chǎn)物積累更多？
  
   

 

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