光電比濁計數法

 一、目的要求
1．了解光電比濁計數法的原理。
2．學(xué)習、掌握光電比濁計數法的操作方法。
二、基本原理
當光線(xiàn)通過(guò)微生物菌懸液時(shí)，由于菌體的散射及吸收作用使光線(xiàn)的透過(guò)量降低。在一定的范圍內，微生物細胞濃度與透光度成反比，與光密度成正比，而光密度或透光度可以由光電池精確測出(圖15-4)。因此，可用一系列已知菌數的菌懸液測定光密度，作出光密度—菌數標準曲線(xiàn)。然后，以樣品液所測得的光密度，從標準曲線(xiàn)中查出對應的菌數。制作標準曲線(xiàn)時(shí)，菌體計數可采用血細胞計數板計數，平板菌落計數或細胞干重測定等方法。本實(shí)驗采用血細胞計數板計數。
光電比濁計數法的優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)便、迅速，可以連續測定，適合于自動(dòng)控制。但是，由于光密度或透光度除了受菌體濃度影響之外，還受細胞大小、形態(tài)、培養液成分以及所采用的光波長(cháng)等因素的影響。因此，對于不同微生物的菌懸液進(jìn)行光電比濁計數應采用相同的菌株和培養條件制作標準曲線(xiàn)。光波的選擇通常在400~700nm之間，具體到某種微生物采用多少還需要經(jīng)過(guò)最大吸收波長(cháng)以及穩定性試驗來(lái)確定。另外，對于顏色太深的樣品或在樣品中還含有其他干擾物質(zhì)的懸液不適合用此法進(jìn)行測定。
（三）器材
1．菌種  釀酒酵母培養液
2．儀器或其他用具  721型分光光度計，血細胞計數板，顯微鏡，試管，吸水紙，無(wú)菌吸管，無(wú)菌生理鹽水等。
（四）操作步驟
1．標準曲線(xiàn)制作
（1）編號  取無(wú)菌試管7支，分別用記號筆將試管編號為1、2、3、4、5、6、7。
（2）調整菌液濃度  用血細胞計數板計數培養24小時(shí)的釀酒酵母菌懸液，并用無(wú)菌生理鹽水分別稀釋調整為每毫升1×106、2×106、4×106、6×106、8×106、10×106、12×106含菌數的細胞懸液。再分別裝入已編好號的1至7號無(wú)菌試管中。
（3）測OD值  將1至7號不同濃度的菌懸液搖均勻后于560nm波長(cháng)、1cm比色皿中測定OD值。比色測定時(shí)，用無(wú)菌生理鹽水作空白對照，并將OD值填入下表
每管菌懸液在測定OD值時(shí)均必須先搖勻后再倒入比色皿中測定
(4)以光密度(OD)值為縱坐標，以每毫升細胞數為橫坐標，繪制標準曲線(xiàn)。
2．樣品測定
將待測樣品用無(wú)菌生理鹽水適當稀釋?zhuān)瑩u均勻后，用560nm波長(cháng)、lcm比色皿測定光密度。測定時(shí)用無(wú)菌生理鹽水作空白對照。
各種操作條件必須與制作標準曲線(xiàn)時(shí)的相同，否則，測得值所換算的含菌數就不準確。
3．根據所測得的光密度值，從標準曲線(xiàn)查得每毫升的含菌數。
（五）實(shí)驗報告
l．結果
每毫升樣品原液菌數=從標準曲線(xiàn)查得每毫升的菌數×稀釋倍數
2．思考題
(1)光電比濁計數的原理是什么?這種計數法有何優(yōu)缺點(diǎn)?
(2)光電比濁計數在生產(chǎn)實(shí)踐中有何應用價(jià)值?
(3)本實(shí)驗為什么采用560nm波長(cháng)測定酵母菌懸液的光密度?如果你在實(shí)驗中需要測定大腸桿菌生長(cháng)的OD值，你將如何選擇波長(cháng)?
  
   

 

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