平板菌落計數法

  （一）目的要求
學(xué)習平板菌落計數的基本原理和方法。
（二）、基本原理
平板菌落計數法是將待測樣品經(jīng)適當稀釋之后，其中的微生物充分分散成單個(gè)細胞，取一定量的稀釋樣液接種到平板上，經(jīng)過(guò)培養，由每個(gè)單細胞生長(cháng)繁殖而形成肉眼可見(jiàn)的菌落，即一個(gè)單菌落應代表原樣品中的一個(gè)單細胞。統計菌落數，根據其稀釋倍數和取樣接種量即可換算出樣品中的含菌數。但是，由于待測樣品往往不易完全分散成單個(gè)細胞，所以，長(cháng)成的一個(gè)單菌落也可來(lái)自樣品中的2～3或更多個(gè)細胞。因此平板菌落計數的結果往往偏低。為了清楚地闡述平板菌落計數的結果，現在已傾向使用菌落形成單位(colony-forming units，cfu)而不以絕對菌落數來(lái)表示樣品的活菌含量。
平板菌落計數法雖然操作較繁，結果需要培養一段時(shí)間才能取得，而且測定結果易受多種因素的影響，但是，由于該計數方法的最大優(yōu)點(diǎn)是可以獲得活菌的信息，所以被廣泛用于生物制品檢驗(如活菌制劑)，以及食品、飲料和水(包括水源水)等的含菌指數或污染程度的檢測。
（三）器材
1．菌種 大腸桿菌菌懸液。
2．培養基 牛肉膏蛋白胨培養基。
3．儀器或其他用具lm1無(wú)菌吸管，無(wú)菌平皿，盛有4.5ml無(wú)菌水的試管，試管架，恒溫培養箱等。
（四）操作步驟
l．編號
取無(wú)菌平皿9套，分別用記號筆標明10-4、10-5、10-6。(稀釋度)各3套。另取6支盛有4.5mL無(wú)菌水的試管，依次標是10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。
2．稀釋
用lmL無(wú)菌吸管吸取lmL已充分混勻的大腸桿菌菌縣液(待測樣品)，精確地放0.5ml至10-1的試管中，此即為10倍稀釋。將多余的菌液放回原菌液中。
將10-1試管置試管振蕩器上振蕩，使菌液充分混勻。另取一支lml吸管插入10 1試管中來(lái)回吹吸菌懸液三次，進(jìn)一步將菌體分散、混勻。吹吸菌液時(shí)不要太猛太快，吸時(shí)吸管伸人管底，吹時(shí)離開(kāi)液面，以免將吸管中的過(guò)濾棉花浸濕或使試管內液體外溢。用此吸管吸取10-1菌液lmL，精確地放0.5mL至10-2試管中，此即為100倍稀釋�！�…其余依次類(lèi)推，整個(gè)過(guò)程如圖15-3所示。
放菌液時(shí)吸管尖不要碰到液面，即每一支吸管只能接觸一個(gè)稀釋度的菌懸液，否則稀釋不精確，結果誤差較大。
3，取樣
用三支1mL無(wú)菌吸管分別吸取10-4、10-5和10-6。的稀釋菌懸液各lmL，對號放入編好號的無(wú)菌平皿中，每個(gè)平皿放0.2mL。
不要用lmL吸管每次只靠吸管尖部吸0.2mL稀釋菌液放入平皿臼，這樣容易加大同一稀釋度幾個(gè)重復平板間的操作誤差。
4．倒平板．
盡快向上述盛有不同稀釋度菌液的平皿中倒入融化后冷卻至45℃左右的牛肉膏蛋白胨培養基約15毫升/平皿，置水平位置迅速旋動(dòng)平皿，使培養基與菌液混合均勻，而又不使培養基蕩出平皿或濺到平皿蓋上。
由于細菌易吸附到玻璃器皿表面，所以菌液加入到培養皿后，應盡快倒入融化并于已冷卻至45℃左右的培養基，立即搖勻，否則細菌將不易分散或長(cháng)成的菌落連在一起，影響計數。
待培養基凝固后，將平板倒置于37℃恒溫培養箱中培養。
5．計數
培養48h后，取出培養平板，算出同一稀釋度三個(gè)平板上的菌落平均數，并按下列公式進(jìn)行計算，
每毫升中菌落形成單位(cfu)=同一稀釋度三次重復的平均菌落數×稀釋倍數×5
 
一般選擇每個(gè)平板上長(cháng)有30~300個(gè)菌落的稀釋度計算每毫升的含菌量較為合適。同一稀釋度的三個(gè)重復對照的菌落數不應相差很大，否則表示試驗不精確。實(shí)際工作中同一稀釋度重復對照平板不能少于三個(gè)，這樣便于數據統計，減少誤差。由10-4、10-5、10-6三個(gè)稀釋度計算出的每毫升菌液中菌落形成單位數也不應相差太大。
平板菌落計數法，所選擇倒平板的稀釋度是很重要的。一般以三個(gè)連續稀釋度中的第二個(gè)稀釋度倒平板培養后所出現的平均菌落數在50個(gè)左右為好，否則要適當增加或減少稀釋度加以調整。
平板菌落計數法的操作除上述傾注倒平板的方式以外，還可以用涂布平板的方式進(jìn)行。二者操作基本相同，所不同的是后者先將牛肉膏蛋白胨培養基融化后倒平板，待凝固后編號，并于37℃左右的溫箱中烘烤30min，或在超靜工作臺上適當吹干，然后用無(wú)菌吸管吸取稀釋好的菌液對號接種于不同稀釋度編號的平板上，并盡快用無(wú)菌玻璃涂棒將菌液在平板上涂布均勻，平放于實(shí)驗臺上20～30min，使菌液滲入培養基表層內，然后倒置37℃的恒溫箱中培養24～48h。
涂布平板用的菌懸液量一般以0.1ml較為適宜，如果過(guò)少菌液不易涂布開(kāi)，過(guò)多則在涂布完后或在培養時(shí)菌液仍會(huì )在平板表面流動(dòng)，不易形成單菌落。
五、實(shí)驗報告
1．結果
2．將培養后菌落計數結果填入下表
                     
2．思考題
(1)為什么融化后的培養基要冷卻至45℃左右才能倒平板?
(2)要使平板菌落計數準確，需要掌握哪幾個(gè)關(guān)鍵?為什么?
(3)試比較平板菌落計數法和顯微鏡下直接計數法的優(yōu)缺點(diǎn)及應用。
(4)當你的平板上長(cháng)出的菌落不是均勻分散的而是集中在一起時(shí)，你認為問(wèn)題出在哪里?
(5)用倒平板法和涂布法計數，其平板上長(cháng)出的菌落有何不同?為什么要培養較長(cháng)時(shí)間(48h)后觀(guān)察結果? 
   

 

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