絲狀真菌形態(tài)特征觀(guān)察

目的

學(xué)習并掌握觀(guān)察毛霉和根霉形態(tài)特征的基本方法。

原理

毛霉和根霉都屬于真菌的接合菌門(mén)。它們是空氣中最常見(jiàn)的污染菌。菌落生長(cháng)迅速，表面呈棉花樣，初為白色，以后變灰至褐灰色。菌絲單細胞無(wú)橫隔，有分枝，多核。毛霉無(wú)假根；根霉有假根和匍匐絲。無(wú)性生殖產(chǎn)生孢囊孢子。孢囊梗直接由菌絲體上長(cháng)出，孢囊梗頂端膨大形成孢囊，孢囊成熟破裂后，露出囊軸，囊軸基部與孢囊梗連接處稱(chēng)為囊托。毛霉無(wú)囊托，根霉的假根上方產(chǎn)生孢囊梗。孢囊孢子呈球形、卵形或不規則形。有性生殖形成接合孢子，常為異宗配合即由“+”“－”型菌絲接合形成。這些結構均可通過(guò)制水壓片在低倍鏡下進(jìn)行觀(guān)察。

很多青霉、曲霉及鐮刀菌尚未發(fā)現它們的有性生殖階段，常稱(chēng)為半知菌。 即只知其生活周期的一半。目前已發(fā)現有些菌的有性階段屬于子囊菌或擔子菌。這三種菌的無(wú)性生殖階段均有特征性的分生孢子梗及分生孢子形態(tài)和分生孢子著(zhù)生方式。它們多是腐生菌，廣泛分布于土壤、空氣、水果和糧食中。青霉菌落多為灰綠色，菌落質(zhì)地絨狀、絮狀、繩狀或束狀，成熟后表面呈粉末狀。青霉菌絲可直接分化形成分生孢子梗，其頂端具有對稱(chēng)或不對稱(chēng)的掃帚狀分枝，其上著(zhù)生幾輪小梗，小梗頂端著(zhù)生成串的球狀或卵狀的綠色分生孢子。曲霉菌落呈絨毛狀或絮狀，表面有同心圓形的輪狀帶。分生孢子梗長(cháng)在厚壁的足細胞上，不分枝，頂端膨大成球形、橢圓形或棍棒狀頂囊。其表面著(zhù)生一層或兩層小梗，下層為柱狀初生小梗，上層為瓶狀次生小梗，頂端著(zhù)生成串的球狀分生孢子。鐮刀菌菌落呈絨毛狀，多為白色、粉紅色或紫紅色。菌絲分隔有分枝。具有兩種分生孢子，小型分生孢子梗分枝或不分枝，其頂端有鏈狀或假頭狀著(zhù)生的小型分生孢子。大型分生孢子梗不分枝，其頂端著(zhù)生鐮刀狀大型分生孢子，多隔，單生或叢生。

載片培養法是研究絲狀真菌生長(cháng)繁殖全過(guò)的有效方法。即將菌絲體接種在載玻片上的小塊培養基薄片上，加蓋蓋玻片，使絲狀真菌只能在載玻片和蓋玻片的狹窄空間內橫向生長(cháng)，因而可觀(guān)察到孢子萌發(fā)、菌絲生長(cháng)及孢子形成的各生長(cháng)階段，且不會(huì )因觀(guān)察而污染標本片。

材料

1．菌種：毛霉（Mucor）“+”、“－”型菌株

根霉（Rhizopus）

青霉（Penicillium sp.）

曲霉（Aspergillus sp.）

鐮刀菌（Fusarium sp.）

2．浮載劑：乳酸酚溶液。

3．培養基：真菌培養基。

4．其它：無(wú)菌培養皿，載玻片，蓋玻片，無(wú)菌水，擦鏡紙，吸水紙及接種鉤。

方法

1．形態(tài)觀(guān)察

（1）直接觀(guān)察：不打開(kāi)培養皿蓋，將培養皿置于載物臺上，在低倍鏡下直接觀(guān)察毛霉和根霉的各部分結構。

（2）制水壓片：取一潔凈載玻片，于中央滴1 滴乳酸酚溶液，用接種針挑取少許菌絲及孢囊于染液中，用兩根接種針將其拉松散，再輕輕蓋上蓋玻片。注意：千萬(wàn)不要有氣泡！置于高倍鏡下進(jìn)行觀(guān)察。

2．毛霉接合孢子觀(guān)察

（1）培養：分別在已倒好馬鈴薯葡萄糖培養基的平皿背面中央劃一條線(xiàn)，于線(xiàn)左右分別標“－”“+”， 然后取相應的毛霉菌株接種，并在26℃ 恒溫箱中倒置培養7 天。

（2）鏡檢：在低倍鏡下沿劃線(xiàn)處尋找接合孢子，在顯微鏡下直接觀(guān)察，或制成水壓片進(jìn)行觀(guān)察。

3．載片培養法觀(guān)察菌體形態(tài)結構

（1）準備材料：在培養皿內放1 張圓形濾紙片，1 個(gè)U 型架，1 片載玻片和2 片蓋玻片，滅菌后備用；

（2）制薄層培養基：取一平底無(wú)菌培養皿，向內倒入約5ml 已融化馬鈴薯葡萄糖培養基，迅速搖勻使成薄層。凝固后，用無(wú)菌解剖刀割為1cm2 小塊；

（3）制片：在無(wú)菌操作下，向U 型棒支撐的載玻片上移入2 小塊培養基，在中央分別接種青霉、曲霉和鐮刀菌，蓋好蓋玻片輕壓勿留氣泡。然后用無(wú)菌滴管向圓濾紙片上滴加滅菌的20% 甘油，至濾紙完全濕潤為止；

（4）培養：26℃~28℃培養3 天后開(kāi)始觀(guān)察。

4．菌落形態(tài)觀(guān)察

   制備查氏培養基平板，在平板中央分別接種青霉、曲霉及鐮刀菌，26℃~28℃下恒溫培養5 天后，觀(guān)察并比較菌落形態(tài)。

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