濾膜法

濾膜由一個(gè)多孔的醋酸纖維、硝酸纖維或混合纖維酯的圓形薄膜構成。濾膜的孔徑范圍從10nm到8μm或更大，對大多數微生物分離和計數時(shí)使用的濾膜孔徑為0.43 ~
0.47μm。少數直徑很小的細菌需要直徑為0.2〜0.22μm的濾膜。

含有方格的膜有助于菌落的計數。為了處理多個(gè)樣品和稀釋液，很多生產(chǎn)廠(chǎng)商生產(chǎn)了使用濾膜的儀器，包括復式接頭濾器。

釆用適當的正壓或負壓，可以使大量的水或水溶液快速通過(guò)，但是膜的微小的孔徑可以阻止細菌的通過(guò)。殘留在濾膜表面上的細苗可通過(guò)將膜放在吸收墊上進(jìn)行培養，該吸收墊飽和地吸收了液體培養基。膜上的毛細孔可以吸收營(yíng)養液并能將營(yíng)養提供給細菌。培養后一個(gè)細菌長(cháng)成一個(gè)菌落。所用的培養基是濾膜法專(zhuān)用的培養基，含有與標準培養基不相同的成分。這種培養基可以在實(shí)驗室自制也可從公司生物公司直接購買(mǎi)脫水制品或配制好的培養基。另外，也可以將濾膜放在配制好的瓊脂培養基表面上進(jìn)行培養。在使用選擇性瓊脂培養基時(shí)，由于培養基的組分不同其擴散率也不同，這會(huì )嚴重影響培養基的選擇性,所以要測定選擇性瓊脂培養基的適用性。

若樣品可以輕易通過(guò)濾膜,那么濾膜菌落計數具有可以從大量樣品中檢測出少量微生物的優(yōu)點(diǎn)。只要濾膜計數具有菌落計數方法的準確度，那么就可以達到多管計數的靈敏度。

另外，當細菌被染色后,將濾膜經(jīng)浸漬油或棉籽油等處理后會(huì )變?yōu)橥该鳡�，這時(shí)就可
進(jìn)行顯微鏡鏡檢。亞甲基藍和結晶紫適用于這種染色。

濾膜可以用于對水、氣體、糖溶液和一些飲料進(jìn)行常規檢驗。如果將乳和乳制品中的脂肪血細胞預先用等辛基苯氧基聚乙氧基乙醇等合適的潤濕劑分解，也可以用濾膜進(jìn)行菌落檢測。

濾膜還有一些其他的用途,如對液體(包括微牛物培養基〉和氣體等進(jìn)行滅菌。在臨床上還能用于無(wú)菌液體的無(wú)菌測試和從細菡中分離噬菌體。

用濾膜法進(jìn)行菌落計數的常規操作步驟：

(1)儀器的滅菌 將濾膜放在濾紙之間，用紙包好，在121℃下高壓滅菌15min.每天實(shí)驗前，將濾器上的螺絲擰松并用紙包好，121℃下高壓滅菌15min。每次過(guò)濾不同樣品前，用酒精擦洗漏斗頂部并用火焰灼燒。

將帶有吸收墊的培養罐或培養皿包好后，高壓滅菌或干熱滅菌。

（2）培養皿的制備 在每個(gè)培養皿中的無(wú)菌吸收墊上無(wú)菌操作加入足量的滅菌培養基，使吸收墊達到飽和，即剛好看不到多余的培養基。

（3）樣品的過(guò)濾和膜的培養 將濾器、抽吸泵以及過(guò)濾瓶連接。取下濾器上部的漏斗，用無(wú)菌的鑷子小心取一片滅菌的濾膜，有格的一面朝上，放在濾器的平面上(操作時(shí)要小心，不要污染漏斗內部)然后將漏斗復位，并將其固定好。

將液體祥品倒入漏斗，用抽吸泵進(jìn)行過(guò)濾。過(guò)濾完樣品后，用25%無(wú)菌Ringer氏溶液潔洗漏斗減小泵的吸力，無(wú)菌操作取下上部漏斗，用無(wú)菌的鑷子將濾膜夾到含有吸收墊的培養皿中，吸收墊預先在合適的培養基浸透過(guò)。將濾膜放在吸收墊上，輕微旋轉，以避免在膜和墊之間產(chǎn)生氣泡。蓋上平皿蓋，蓋朝上放入培養箱培養，培養的時(shí)間一般小于平板計數的培養時(shí)間。

培養后記下菌落數并計算每毫升或每克樣品的菌落數。有時(shí)菌落的顏色和膜的顏色無(wú)明質(zhì)反差，這時(shí)需要對膜或菌落染色，以便準確計數。染色程序如下：

(1)孔雀石綠膜染色法培養后，將膜在0.01%的孔雀石綠水溶液中浸泡3〜10s，過(guò)量的染色液倒入裝有消毒液的缸中。這種方法只對膜染色，而對菌落不染色。

(2)亞甲基藍齒落染色法用0.01%亞甲基藍水溶液使吸收墊達到飽和。然后將帶菌的濾膜在吸收墊上放置5min,將膜移到浸透過(guò)水的吸收墊上。亞甲基藍從膜上的脫色速度快于從菌落上的脫色速度，菌落與膜有明顯的色差時(shí)就可以進(jìn)行菌落計數。

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