酵母菌的形態(tài)觀(guān)察

 一、實(shí)驗目的和內容
目的：了解自然存在的酵母菌及其形態(tài)結構。了解酵母菌產(chǎn)生子囊孢子的條件及其形態(tài)。
內容：
1．觀(guān)察酵母菌個(gè)體形態(tài)。
2．觀(guān)察酵母菌的假菌絲和繁殖過(guò)程。
3．觀(guān)察自然狀態(tài)的酵母菌。
二、實(shí)驗材料和用具
釀酒酵母(Saccharomyes cerevisiae)、熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)斜面菌種。
PDA培養基、麥氏(McCLary)培養基(醋酸鈉培養基)、0.05%美藍染色液(以pH6.0的0.02mol/L磷酸緩沖液配制)、碘液、0.04%的中性紅染色液%孔雀綠，0.5%沙黃液、95%乙醇；
顯微鏡、載玻片、擦鏡紙、蓋玻片、接種環(huán)、V形玻璃棒、放置一個(gè)三角形玻璃棒支架的培養皿。
三、操作步驟
(一)酵母菌形態(tài)觀(guān)察
1．酵母菌的話(huà)體染色觀(guān)察及死亡率的測定
(1)以無(wú)菌水洗下PDA斜面培養的釀酒酵母菌苔，制成菌懸液。
(2)取0.05%美藍染色液1滴，置載玻片中央，并用接種環(huán)取酵母菌懸液與染色液混勻，染色2～3min，加蓋玻片，在高倍鏡下觀(guān)察酵母菌個(gè)體形態(tài)，區分其母細胞與芽體，區分死細胞(藍色)與活細胞(不著(zhù)色)。
(3)在一個(gè)視野里計數死細胞和活細胞，共計數5～6個(gè)視野。
酵母菌死亡率一般用百分數來(lái)表示，以下式來(lái)計算：
 
死亡率=死細胞總數÷死活細胞總數×100%
 
2．酵母菌液泡系的話(huà)體觀(guān)察   于潔凈載玻片中央加一滴中性紅染色液，取少許上述酵母菌懸液與之混合，染色5min，加蓋玻片在顯微鏡下觀(guān)察。細胞無(wú)色，液泡呈紅色。
3．酵母菌細胞中肝糖粒的觀(guān)察   將1滴碘液置于載玻片中央，接人上述酵母菌懸液，混勻，蓋上蓋玻片，顯微鏡觀(guān)察，細胞內的貯藏物質(zhì)肝糖顆粒呈深紅色。
4．酵母菌子囊孢子的觀(guān)察  
(1)活化釀酒酵母：將釀酒酵母接種至新鮮的麥芽汁培養基上，置28C培養2～3d，然后再移植2～3次。
(2)轉接產(chǎn)孢培養基：將活化的釀酒酵母轉接至醋酸鈉培養基上，置30℃恒溫培養14d。
(3)觀(guān)察：挑取少許產(chǎn)孢菌苔于載玻片的水滴上，經(jīng)涂片、熱固定后，加數滴孔雀綠，lmin后水洗，加95%乙醇30S，水洗，最后用0.5%沙黃液復染30S，水洗去染色液，最后用吸水紙吸干。制片干燥后，鏡檢，子囊孢子呈綠色，子囊為粉紅色。注意觀(guān)察子囊孢子的數目、形狀和子囊的形成率。
(4)計算子囊形成的百分率：計數時(shí)隨機取3個(gè)視野，分別計數產(chǎn)子囊孢子的子囊數和不產(chǎn)孢子的細胞，然后按下列公式計算：
 
子囊形成率（%）=3個(gè)視野中形成子囊的總數
÷3個(gè)視野中（形成子囊的總數+不產(chǎn)孢子細胞總數）×100%
 
5．酵母菌假菌絲的觀(guān)察    取一無(wú)菌載玻片浸于溶化的PDA培養基中，取出放在溫室培養的支架上，待培養基凝固后，進(jìn)行酵母菌劃線(xiàn)接種，然后將無(wú)菌蓋玻片蓋在接菌線(xiàn)上(圖12—1)，28℃培養2～3d后，取出載玻片，擦去載玻片下面的培養基，在顯微鏡下直接觀(guān)察�？梢�(jiàn)到芽殖酵母形成的藕節狀假菌絲，裂殖酵母則形成竹節狀假菌絲(圖12—2)。
6．自然狀態(tài)下的酵母菌觀(guān)察   取一滴美藍染色液于載玻片中央，春夏秋季取醬油或淹菜上的白膜，冬季取腌酸菜湯上的白膜，將其置于載玻片染色液中，蓋上蓋玻片，顯微鏡下仔細觀(guān)察酵母菌形態(tài)，出芽生殖，假菌絲等。
四、注意事項
1．用于活化酵母菌的麥芽汁培養基要新鮮、表面濕潤。
2．在產(chǎn)孢培養基上加大移種量，可提高子囊形成率。
3．通過(guò)微加熱增加酵母的死亡率，易于觀(guān)察死亡細胞。
五、實(shí)驗報告
(一)繪圖
1．數個(gè)酵母菌細胞，示觀(guān)察到的結構。
2．數個(gè)子囊及子囊孢子形態(tài)圖。
(二)記錄并計數酵母菌的死亡率及子囊形成率(原始記錄及計算結果)。
六、問(wèn)題和思考
1．酵母菌的假菌絲是怎樣形成的?與霉菌的真菌絲有何區別?
2．如何區別營(yíng)養細胞和釋放出的子囊孢子?
3．試設計一個(gè)從子囊中分離子囊孢子的試驗方案。
 
注：
酵母菌的簡(jiǎn)易培養   配2%葡萄糖水(或自糖水)，煮沸，裝入三角瓶中(液面高度2～2cm )，加HCl調至pH3～5放入幾塊葡萄皮（或其他糖分較高的果皮），置5～28℃溫箱中培養2～3d，聞到酒香味后，即可取培養液鏡檢
  
   

 

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