生化鑒定試驗——酶類(lèi)試驗

1.觸酶試驗

(1)原理:具有觸酶(過(guò)氧化氫酶)的細菌，能催化過(guò)氧化氫，放出新生態(tài)氧，繼而形成分子氧，出現氣泡。

(2) 方法:取3 %過(guò)氧化氫溶液0.5 時(shí)，滴加于不含血液的細菌瓊脂培養物上，或取1~3 ml 、滴加入鹽水菌懸液中。

(3) 結果判斷:培養物出現氣泡者為陽(yáng)性(圖3 - 37) 。

(4) 注意事項: ①細菌要求新鮮。②因紅細胞內含有觸酶，可能出現假陽(yáng)性，故不宜用血瓊脂平板上的菌落作觸酶試驗。③需用已知陽(yáng)性菌和陰性菌作對照。

2.氧化酶試驗

(1)原理:氧化酶(細胞色素氧化酶)是細胞色素呼吸酶系統的酶。具有氧化酶的細菌，首先使細胞色素C氧化，再由氧化型細胞色素C 使對苯二膠氧化，生成有色的釀類(lèi)化合物。

(2) 方法:取潔凈的濾紙一小塊，涂抹菌苔少許，加1 滴10 g/ L 對苯二股溶液于菌落上，觀(guān)察顏色變化。

(3) 結果判斷: 立即呈粉紅色并迅速轉為紫紅色者為陽(yáng)性(圖3 - 38) 。

(4) 注意事項: ①未加抗壞血酸的試劑需每周新鮮配制(試劑在空氣中易發(fā)生氧化) 。②避免接觸含鐵物質(zhì)。③不宜采用含葡萄糖的培養基上的菌落(葡萄糖發(fā)酵可抑制氧化酶活性) 。

3.靛酚氧化酶試驗

(1)原理:具有氧化酶的細菌，首先使細胞色素C 氧化，再由氧化型細胞色素C 使鹽酸對二甲氨基苯膠氧化，并與α 荼酣結合，生成靛酚藍而呈藍色。

(2) 方法:取靛酚氧化酶試紙條，用無(wú)菌鹽水浸濕后，直接蘸取細菌培養物，立即觀(guān)察結果。

(3) 結果判斷:試紙條在10s 內變成藍色者為陽(yáng)性(圖3 - 39) 。

4.凝固酶試驗

(1)原理: 金黃色葡萄球菌可產(chǎn)生兩種凝固酶。一種是結合凝固酶，結合在細胞壁上，使血漿中的纖維蛋白原變成纖維蛋白而附著(zhù)于細菌表面，發(fā)生凝集，可用玻片法測出。另一種是菌體生成后釋放于培養基中的游離凝固酶，能使凝血酶原變成凝血酶類(lèi)物質(zhì)，從而使血漿凝固，可用試管法測出。

(2) 玻片法:取兔或混合人血漿和鹽水各l 滴分別置清潔載玻片上，挑取待檢菌菌落分別與血漿及鹽水混合。如血漿中有明顯的顆粒出現而鹽水中無(wú)自凝現象者為陽(yáng)性(圖3 - 40) 。

(3) 試管法:取試管2 支，分別加入0 . 5 ml 的血漿(經(jīng)生理鹽水1:4 稀釋) .挑取菌落數個(gè)加入測定管充分研磨溫勻，用已知陽(yáng)性菌株加入對照管. 3 7℃水浴3~4 h 。血漿凝固者為陽(yáng)性(圖3-41)。

5. DNA 酶試驗

(1)原理: 某些細菌可產(chǎn)生細胞外DNA 酶。DNA 酶可水解DNA 長(cháng)鏈，形成數個(gè)單核昔酸組成的寡核昔酸鏈。長(cháng)鏈DNA 可被酸沉淀，而水解后形成的寡核昔酸鏈則可溶于酸，當在菌落平板上加入酸后，若在菌落周圍出現透明環(huán)，表示該菌具有DNA 酶。

(2) 方法:將待檢菌點(diǎn)狀接種于DNA 瓊脂平板上.3 5℃培養18~24 h. 在細菌生長(cháng)物上加一層1 mo l/ L 鹽酸(使菌落浸沒(méi))。

(3) 結果判斷: 菌落周圍出現透明環(huán)為陽(yáng)性，無(wú)透明環(huán)為陰性(圖3 - 42) 。

(4) 注意事項: 腸桿菌科中的沙雷菌和變形桿菌可產(chǎn)生DNA 酶，革蘭陽(yáng)性球菌中，只有金黃色葡萄球菌產(chǎn)生DNA 酶，因此可資鑒別。

6 . 硝酸鹽還原試驗

(1)原理: 硝酸鹽培養基中的硝酸鹽可被某些細菌還原為亞硝酸鹽，后者與乙酸作用生成亞硝酸。亞硝酸與對氨基苯磺酸作用，形成偶氮苯磺酸，再與α 荼膠結合成紅色的N-α 荼膠偶氮苯磺酸。

(2) 方法: 將待檢菌株接種于硝酸鹽培養基， 35℃孵育1~2 日，加入試劑甲液(對氨基苯磺酸和乙酸)和乙液(α 荼肢和乙酸)各2 滴，立即觀(guān)察結果。

(3) 結果判斷: 呈紅色者為陽(yáng)性(圖3 - 43) 。若不呈紅色，再加入少許辭粉，如仍不變?yōu)榧t色者為陽(yáng)性，表示培養基中的硝酸鹽已被細菌還原為亞硝酸鹽，進(jìn)而分解成氨和氮。加辭粉后變?yōu)榧t色者為陰性，表示硝酸鹽未被細菌還原，紅色反應是由于辭粉的還原所致。

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