細菌芽孢、莢膜的染色及觀(guān)察

 一、實(shí)驗目的和內容
目的：掌握細菌的芽孢及莢膜染色方法。
內容：1．細菌的芽泡染色。
  2．細菌的莢膜染色。
二、實(shí)驗材料和用具
枯草芽孢桿菌、褐球固氮菌的斜面菌種。
二甲苯、香柏油、蒸餾水、5%孔雀綠水溶液、0.5%沙黃水溶液(或0.05%堿性復紅)、繪圖墨水(用濾紙過(guò)濾后備用)、95%乙醇、石炭酸復紅染液；
顯微鏡、接種環(huán)、酒精燈、載玻片、蓋玻片、小試管(l×6.5cm)、燒杯(300mL)、滴管、試管夾、擦鏡紙、吸水紙。
三、操作步驟
(一)芽孢染色法
1．方法1
(1)取37℃培養18～24h的枯草芽孢桿菌作涂片，并干燥，固定(參見(jiàn)“細胞單染色法”)。
(2)于涂片上滴人3～5滴5%孔雀綠水溶液。
(3)用試管夾夾住載玻片在火焰上用微火加熱，自載玻片上出現蒸汽時(shí)，開(kāi)始計算時(shí)間約4～5min。加熱過(guò)程中切勿使染料蒸干，必要時(shí)可添加少許染料。
(4)傾去染液，待玻片冷卻后，用自來(lái)水沖洗至孔雀綠不再褪色為止。
(5)用0.5%沙黃水溶液(或0.05%堿性復紅)復染lmin，水洗。
(6)制片干燥后用油鏡觀(guān)察。芽孢呈綠色，菌體紅色。
2．方法2
(1)加1～2滴自來(lái)水于小試管中，用接種環(huán)從斜面上挑取2～3環(huán)培養18～24h的枯草芽孢桿菌菌苔于試管中，并充分混勻打散，制成濃稠的菌液。
(2)加5%孔雀綠水溶液2～3滴于小試管中，用接種環(huán)攪拌使染料與菌液充分混合。
(3)將此試管浸于沸水浴(燒杯)中，加熱15～20min。
(4)用接種環(huán)從試管底部挑數環(huán)菌于潔凈的載玻片上，并涂成薄膜，將涂片通過(guò)微火3次固定。
(5)水洗，至流出的水中無(wú)孔雀綠顏色為止。
(6)加沙黃水溶液，染2～3min后，傾去染液，不用水洗，直接用吸水紙吸干。
(7)干燥后用油鏡觀(guān)察。芽孢綠色，菌體紅色。
(二)莢膜染色法
1．石炭酸復紅染色
（1）取培養了72h的褐球固氮菌制成涂片，自然干燥(不可用火焰烘干)。
（2）滴入1～2滴95%乙醇固定(不可加熱固定)。
（3）加石炭酸復紅染液染色1～2min，水洗，自然干燥。
 (4) 在載玻片一端加一滴墨汁，另取一塊邊緣光滑的載玻片與墨汁接觸，再以勻速推向另一端，涂成均勻的一薄層，自然干燥。
(5)干燥后用油鏡觀(guān)察。菌體紅色，莢膜無(wú)色，背景黑色。
2．背景染色
(1)先加1滴墨水于潔凈的玻片上，并挑少量褐球固氮菌與之充分混合均勻。
(2)放一清潔蓋玻片于混合液上，然后在蓋玻片上放一張濾紙，向下輕壓，吸收多余的菌液。
(3)干燥后用油鏡觀(guān)察。背景灰色，菌體較暗，在其周?chē)�呈現一明亮的透明圈即莢膜。
四、注意事項
1．莢膜染色涂片不要用加熱固定，以免莢膜皺縮變形。
2．供芽孢染色用的菌種應控制菌齡，使大部分芽孢仍保留在菌體上為宜。
五、實(shí)驗報告
(一)繪圖
1．枯草芽孢桿菌及巨大芽孢桿菌的菌體及芽孢形態(tài)，芽孢的著(zhù)生位置。
2．褐球固氮菌菌體及莢膜的形態(tài)。
(二)試制片，但不進(jìn)行染色，觀(guān)察是否能看到芽孢和莢膜?
七、問(wèn)題和思考
1．為什么芽孢染色要加熱?為什么芽孢及營(yíng)養體能染成不同的顏色?
2．組成莢膜的成分是什么?涂片一般用什么固定方法，為什么?
3．試設計實(shí)驗如何鑒定某一產(chǎn)芽孢菌株的芽孢形態(tài)、著(zhù)生位置及所屬分類(lèi)地位。
  
   

 

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