海博微信公眾號
海博天貓旗艦店
海博微信公眾號
海博天貓旗艦店
1．了解稀釋法分離土壤微生物的原理。
2．學(xué)習并掌握由土壤分離細菌和真菌的方法。
3，掌握有目的分離有益微生物的原理和技術(shù)。
原理
土壤是微生物棲居的大本營(yíng)，各種各樣的微生物都雜居在一起。當我們需要某種微生物時(shí)，即可通過(guò)提供適宜的營(yíng)養條件，或添加只利于所需菌生長(cháng)而抑制其它菌生長(cháng)的抑制劑，有選擇地將所需菌分離出來(lái)，這種技術(shù)即稱(chēng)為微生物的分離與純化。稀釋法常用于分離土壤、各種水域及基物表面的微生物。其原理是：先將土壤樣品進(jìn)行一系列倍比稀釋?zhuān)缓髮讉�(gè)適當濃度的稀釋液均勻涂布于分離培養基表面。經(jīng)培養后，土壤中的單個(gè)微生物細胞或孢子即可在培養基表面形成肉眼可見(jiàn)的菌落。再將所需菌落轉入試管斜面,然后經(jīng)平板劃線(xiàn)再次取得單菌落后，即可得到所需菌種的純菌株。因此，本方法的最大特點(diǎn)是可以對土壤樣品進(jìn)行活菌計數，同時(shí)，如果采用選擇性培養基，可以分離到目的菌株。其全過(guò)程見(jiàn)圖24-1。
本方法分離土壤微生物具有一定的局限性，首先，由于采用平板培養，絕對厭氧的微生物不宜在平板上生長(cháng)，如果需要分離厭氧微生物，還需要厭氧操作裝置。其次，采用的幾種培養基不一定能適于土壤中所有的微生物生長(cháng)，特別是那些目前尚不能在人工培養基上生長(cháng)的微生物。本實(shí)驗選擇細菌、放線(xiàn)菌和真菌的最適培養基，對各大類(lèi)微生物進(jìn)行分離和活菌計數。
本實(shí)驗還針對可以產(chǎn)生纖維素酶的微生物而設計了選擇性分離培養基。分別根據分離目的設計出相應的篩選模型。制備含有不同底物的培養基平板，將稀釋的土壤懸液涂布，或將分離到的菌株直接點(diǎn)接在選擇性平板表面，置適宜溫度培養后，可通過(guò)肉眼觀(guān)察來(lái)判斷目的需要的目的菌株。
材料
1．樣品：過(guò)篩（孔徑約2mm）的新鮮土壤樣品（使用前先測定含水量）。
2．培養基：在300ml 三角瓶中分別分裝150ml 牛肉膏蛋白胨培養基、馬鈴薯葡萄糖培養基和高氏1 號培養基。
3．選擇性培養基：纖維素酶產(chǎn)生菌分離培養基 （選做）
4．滅菌物品：250ml 三角瓶分裝90ml 無(wú)菌水（內含20-30 粒玻璃珠），18×180mm 試管分裝9ml 無(wú)菌水，培養皿，1ml 吸管，玻璃刮鏟。
方法
1．制備土壤稀釋液：用小天平稱(chēng)分別稱(chēng)取少時(shí)潮濕的菜園土和風(fēng)干的菜園土各10g，置于90ml 含玻璃珠的無(wú)菌水中，震蕩10min，靜置30 秒后，即得土壤原液（10－1）。再用1ml 無(wú)菌吸管吸取1ml 上清液加到9ml 無(wú)菌水中，充分搖勻，即得（10－2）稀釋液。依次類(lèi)推，潮濕土制得10－1 至10－6 稀釋液； 風(fēng)干土制備10－1 至10－4 稀釋液；
2．分離：
（1）細菌的分離（基內接種）
a.．取9 個(gè)無(wú)菌平皿，用1ml 無(wú)菌吸管分別吸取0.1ml 10－4、10－5 及10－6 潮濕土的土壤稀釋液，接入平皿，每一稀釋度設3 個(gè)重復，
b．將已融化并冷卻至45℃左右的細菌培養基倒入無(wú)菌培養皿中，每皿約15ml，共9 個(gè)平皿，與菌液充分混勻，凝固后，在平皿上作好培養基種類(lèi)、稀釋度、組號及日期標記；
c．將平板倒置，37℃培養2~3 天后觀(guān)察并計數。
（2）放線(xiàn)菌的分離（表面接種）
a．將已融化的150ml 高氏一號培養基中加入2 滴10%重鉻酸鉀溶液，充分混勻后倒入無(wú)菌培養皿中，每皿約15ml，共9 個(gè)平皿，凝固后，在平皿上作好培養基種類(lèi)、稀釋度、組號及日期標記；
b．用1ml 無(wú)菌吸管分別取0.1ml 10－3、10－4 及10－5 風(fēng)干土的土壤稀釋液，接入培養基表面，每一稀釋度3 個(gè)重復；
c．用無(wú)菌玻璃刮鏟，按稀釋度由高到低順序依次輕輕涂布，不要刮破培養基表面；
d．將平板倒置，37℃培養5~7 天后觀(guān)察并計數。
（3）真菌的分離（表面接種）
a．將已融化的150ml PDA 培養基冷卻到50℃左右，加入0.3ml 鏈霉素溶液（1000/ml），充分混勻后倒入無(wú)菌培養皿中，每皿約15ml，共9 個(gè)平皿，凝固后，在平皿上作好培養基種類(lèi)、稀釋度、組號及日期標記；
b．用1ml 無(wú)菌吸管分別取0.1ml 10－3、10－4 及10－5 潮濕土的土壤稀釋液，接入培養基表面，每一稀釋度3 個(gè)重復；
c．用無(wú)菌玻璃刮鏟按稀釋度由高到低順序依次輕輕涂布，不要刮破培養基表面；
d．將平板倒置，26℃~28℃培養3 天后觀(guān)察并計數。
結果
1．活菌計數：
計數時(shí)通常選用每種微生物生長(cháng)的最適稀適度的三個(gè)平皿計數， 如細菌、放線(xiàn)菌和酵母菌以每皿30~300 個(gè)菌落為宜，絲狀真菌則以每皿10~100 個(gè)菌落為宜。將原始結果填入下表，根據事先測定的土壤含水量，按公式計算出每個(gè)干土中微生物的量。
2．檢查每皿中的優(yōu)勢菌種，可根據菌落特征、制水壓片、染色制片等觀(guān)察菌體形態(tài)；
3．純培養：記錄優(yōu)勢菌株的菌落特征并編號，然后將其劃線(xiàn)接入試管斜面。根據已掌握的知識進(jìn)行判斷，細菌用牛肉膏蛋白胨培養基，放線(xiàn)菌用高氏一號培養基，真菌用PAD培養基。見(jiàn)圖24-3。分別在相應培養基平板上劃線(xiàn)分離單菌落，待長(cháng)好后再次劃線(xiàn)接入試管斜面，以備鑒定、保存使用。
下一篇：PCR技術(shù)
