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細胞培養法是目前培養病毒應用最廣的一種培養方法，其優(yōu)點(diǎn)是（1）經(jīng)濟適用，結果正確且敏感；（2）較實(shí)驗動(dòng)物易于控制。細胞培養法多應用于病毒的分離培養，進(jìn)行血清中和試驗及制造疫苗和抗原等方面。很多組織細胞，包括雞胚、鼠胚、各種動(dòng)物的腎組織細胞，人胚羊膜組織細胞或流產(chǎn)胎兒組織細胞（應在死后6 小時(shí)內采取，因時(shí)間過(guò)長(cháng)，組織細胞生長(cháng)成功率下降）等均可作細胞培養的來(lái)源。
細胞的選擇主要依據組織細胞對病毒的敏感性。能引起病變的組織細胞，往往取自病毒的自然宿主，特別是引起疾病的宿主的某些臟器組織細胞。人類(lèi)病毒，用人或猴的組織細胞較敏感，但這不是絕對的，如地鼠腎細胞較人腎細胞對流行性乙型腦炎病毒敏感。
（一） 原代細胞培養法
【材料】
9～10 日齡雞胚、Hanks 氏溶液、0.25％胰酶溶液、無(wú)菌小剪、鑷子、無(wú)菌培養皿、毛細吸管、吸管、沉淀管、無(wú)菌細胞培養管（抗生素空瓶）、100 毫升無(wú)菌玻璃瓶或三角燒瓶、備有四層紗布的玻璃漏斗。
【方法】
1．用碘酒消毒雞胚蛋氣室外殼，并將它直立于蛋架上，以鑷子將雞胚取出放入無(wú)菌培養皿內，去頭爪及內臟。
2．用小剪在培養皿內將胚胎剪成小塊（4～5 毫米3），加Hanks 氏溶液（約10毫升）沖洗，靜置1～2 分鐘后，用毛細吸管吸取液體。依同法再洗滌2 次，將血球充分洗去。
3．用鑷子將組織塊放入無(wú)菌玻璃瓶或三角燒瓶?jì)�，加�?/span>10～15 毫升0.25％胰酶溶液，37℃水浴20 分鐘，中間搖動(dòng)幾次。由于胰酶的作用可使大量細胞游離，液體變混。經(jīng)四層紗布過(guò)濾后的細胞懸液，低速離心沉淀（1000 轉/分以?xún)龋?/span>5 分鐘，吸取上清液，沉淀物加入適量營(yíng)養液，用白細胞計數的方法進(jìn)行計數，使成每毫升含50～80 萬(wàn)細胞懸液以作單層細胞培養。
4．每一細胞培養管，注入細胞懸液1 毫升，蓋好瓶塞，并將瓶略加搖動(dòng)，橫臥于有槽木架上，使細胞均勻平鋪于管壁。置37℃溫箱孵育，一般4 小時(shí)，細胞附著(zhù)于管壁，48 小時(shí)可長(cháng)成單層，此時(shí)即可調換營(yíng)養液，接種病毒。
（二） 傳代細胞培養法
從人及動(dòng)物組織，特別是腫瘤組織，經(jīng)過(guò)多次傳代可建立傳代細胞系。這種細胞能無(wú)限地傳代，但并不是所有的組織細胞都能建立傳代細胞。有一些傳代細胞對病毒敏感范圍較廣，曾被利用作病毒的分離和鑒定。如HeLa 細胞，Hep－2 細胞及KB 細胞。HeLa 細胞對脊髓灰質(zhì)炎三型病毒，腺病毒及大多數實(shí)驗室適應的ECHO 病毒都敏感。Hep－2 細胞也曾用來(lái)分離脊髓灰質(zhì)炎病毒、柯薩奇A 組病毒、腺病毒、RS 病毒。HeLa 細胞來(lái)自子宮頸癌，Hep－2 細胞來(lái)自喉癌，而KB 細胞來(lái)自上腭癌。由于傳代細胞有致腫瘤作用，目前僅用做病毒的分離鑒定及一些病毒學(xué)的研究而不能用于疫苗的生產(chǎn)。
【材料】
單層細胞培養瓶，營(yíng)養液，0.25％胰蛋白酶溶液，無(wú)菌吸管，無(wú)菌細胞瓶。
【方法】
1．將成片細胞的生長(cháng)液倒掉，用Hanks 液洗一次。
2．加入適量的0.25％胰蛋白酶，37℃孵育1 分鐘。
3．將細胞瓶倒放，細胞在上，胰酶在下，繼續孵育37℃5～10 分鐘。
4．將胰蛋白酶倒掉，再加入原量的生長(cháng)液，用10 毫升吸管吹打分散細胞。
5．用生長(cháng)液按原量3～4 倍稀釋?zhuān)匆黄考毎軅?/span>3～4 瓶。
（三） 細胞培養接種病毒的方法及病變觀(guān)察
【材料】
單層細胞培養管、營(yíng)養液、Hanks 溶液、無(wú)菌毛細滴管和腺病毒稀釋液。
【方法】
1．取已長(cháng)成單層細胞的培養瓶二只，用無(wú)菌毛細滴管吸去管中液體，用Hanks溶液洗二次。
2．用無(wú)菌的1 毫升吸管吸稀釋的腺病毒液0.1 毫升加入一只單層細胞培養瓶中，另一只加0.1 毫升營(yíng)養液不接種病毒作為對照，細胞瓶放平，使其接觸整個(gè)細胞層，置37℃作用1 小時(shí)，使病毒吸附到細胞上。
3．取出單層細胞瓶，每只中加入營(yíng)養液0.9 毫升，蓋緊后置37℃孵箱中培養1～2 天。
4．取出細胞在低倍顯微鏡下觀(guān)察，注意種毒與對照二管的細胞形態(tài)，排列等。
注：為方便保存，此處觀(guān)察的細胞已經(jīng)過(guò)固定和染色。
上一篇：病毒動(dòng)物接種法
