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一、目的
學(xué)習和掌握篩選營(yíng)養缺陷型突變株的原理及方法。
二、原理
營(yíng)養缺陷型是指野生型菌株由于基因突變，致使細胞合成途徑出現某些缺陷，喪失合成某些物質(zhì)的能力，因而必須在基本培養基中補加該營(yíng)養物質(zhì)才能正常生長(cháng)的一類(lèi)突變菌株。由于減低或消除了末端產(chǎn)物濃度，可解除反饋代謝調控，使代謝途徑中間產(chǎn)物或分枝合成途徑中末端產(chǎn)物得以積累。所以營(yíng)養缺陷型菌株被廣泛用于氨基酸、核苷酸、維生素的生產(chǎn)中，也廣泛用于基因定位、雜交及基因重組等研究中的遺傳標記。
三、材料
1.菌種 枯草桿菌（B.subtilis）。
2.培養基
(1)細菌完全培養基(CM)。
(2)細基本培養基（MM）
(3)無(wú)氮基本培養基（基本培養棊中不加(NH4)SO4和瓊脂）。
(4)2倍氮源基本培養基〔基本培養基中加入2倍(NH4)SO4，不加瓊脂〕
(5)限制培養基（SM）（液體基本培養基中加入0.1%~0.5%的完全培養基和2%瓊脂）。
3.溶液
(1)無(wú)維生素的酪素水解物或氮基酸混合液。
(2)水溶性維生索混合液。
(3)核酸（RNA）水解液 制作法：取2gRNA，加入15ml 1mol/L NaOH; 另取2gRNA,加入15ml 1mol/L HCL，分別于100℃水浴加熱水解20min后混合，調整pH為6.0,過(guò)濾后調整體積為40ml。
4.設備及器皿 誘變箱、離心機、直徑90mm培養皿，250ml三角瓶。
四、方法與步驟
1.出發(fā)菌株 取新活化的枯草桿菌斜面菌種1環(huán)，加人裝有20ml完全培養基的
250ml三角瓶中， 30℃振蕩培養16~18h，取1ml培養液轉接于另一只裝有20ml完全培養基的250ml三角瓶中， 30℃振蕩培養6h，使細胞處于對數生長(cháng)狀態(tài)。
2.細胞懸液的制備
（1）取10ml培養液，離心3500r/min,10min)收集菌體，用生理鹽水離心洗滌2
次，而后將菌體充分懸浮于11ml生理鹽水中，調整細胞濃度為108個(gè)/ml。
（2）以活菌計數法測定細胞懸液濃度。
3.誘變處理 取10ml處理菌液于直徑90mm培養皿中（帶磁棒〉，用紫外線(xiàn)照射60s 。4.中間培養 取1ml處理菌液轉人裝有20ml液體完全培養基的250ml三角瓶中，30℃振蕩培養過(guò)夜。
五、淘汰野生型(青霉素法〉
（1）取10ml中間培養液，離心（3500r/min,10min）收集菌體，用生理鹽水離心洗滌2次，之后將菌體轉入10ml無(wú)氮基本培養基中，30℃振蕩培養6~8h（饑餓培養）。
（2）將全部菌液轉入10ml 2倍氮源基本培養中，30℃振蕩培養1〜2h加入終濃度為
100u/ml的青霉素（母液濃度為2000u/ml）繼續培養5〜6h殺死野生型細胞，濃縮缺陷型細胞。
（3）取10ml菌液，離心收集菌體，用生理鹽水離心洗滌-次，而后將菌體充分懸浮于10ml生理鹽水中。
六、營(yíng)養缺陷型菌株的檢出（逐個(gè)檢出法〉
（1）取0.1ml菌懸液，涂布于限制培養基平板上|（3個(gè)平板以上〕，30℃培養48h,野生型形成大菌落，缺陷型為小菌落。
（2）制備完全培養基和基本培養基平板各4個(gè)，并在皿的背面劃好方格〔毎皿以30個(gè)格左右為好〕
（3）用牙簽從限制培養基平板上逐個(gè)挑取小菌落，對應點(diǎn)接在基本培養基平板和完全
培養基平板上（先點(diǎn)接似MM平板，后點(diǎn)接CM平板）。30℃培養48h將在完全培養基平板生長(cháng)，而在基本培養基平板上相對應位置上不生長(cháng)的菌落，接入完全培養基斜面，30℃培養24h作為營(yíng)養缺陷型鑒定用菌株。
七、營(yíng)養缺陷型菌株的鑒定
（1）取待測菌株斜面1環(huán)接于5ml生理鹽水中，充分混勻，離心收集菌體，然后，將菌體充分懸浮于5ml生理鹽水中。
（2）取1ml菌懸液與平皿中，傾入約15ml融化并冷卻至45~50℃的基本培養基，制成待測平板。
（3）將待測平板背面劃分成3個(gè)區域，在平板表面3個(gè)區域分別貼上蘸有氨基酸混合液，維生素混合液，核酸水解液的濾紙片，30℃培養24h。觀(guān)察濾紙片周?chē)渖L(cháng)情況。在濾紙片周?chē)L(cháng)的菌株，即為相應的營(yíng)養缺陷型菌株。
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