細菌的革蘭氏染色

 目的：初步掌握細菌涂片方法及革蘭氏染色法步驟。
內容：1．制作細菌染色裝片。
  2．進(jìn)行革蘭氏染色法操作。
二、實(shí)驗材料和用具
蘇云金桿菌或金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大腸桿菌(E.coli)菌液，待測菌菌液1～2種。
革蘭氏染色液(結晶紫染液、盧戈氏碘液、95%乙醇、石炭酸復紅液等)、香柏油、二甲苯；顯微鏡、擦鏡紙、接種環(huán)、載玻片、吸水紙、試管、小滴管、酒精燈。
三、操作步驟
(一)制片
1．涂菌   用無(wú)菌操作方法從試管中沾取菌液一環(huán)，用接種環(huán)在潔凈無(wú)脂的載玻片上做一薄而均勻、直徑約lcm的菌膜。涂菌后將接種環(huán)火焰滅菌。
2．干燥   于空氣中自然干燥。亦可把玻片置于火焰上部略加溫加速干燥(溫度不宜過(guò)高)。
3．固定   目的是殺死細菌并使細菌粘附在玻片上，便于染料著(zhù)色，常用加熱法，即將細菌涂片膜向上，通過(guò)火焰3次，以熱而不燙為宜，防止菌體燒焦、變形。此制片可用于染色。
(二)染色
l．初染   于制片上滴加結晶紫染液，染lmin后，用水洗去剩余染料。
2．媒染   滴加盧戈氏碘液，lmin后水洗。
3．脫色   滴加95%乙醇脫色，搖動(dòng)玻片至紫色不再為乙醇脫退為止 (根據涂片之厚薄需時(shí)30s至lmin)，水洗。
4．復染   滴加石炭酸復紅液復染lmin，水洗。
5．濾紙吸干，油鏡鏡檢。
(三)結果
革蘭氏陽(yáng)性菌染成藍紫色，革蘭氏陰性菌染成淡紅色。
(四)檢測未知菌
用以上方法對未知菌進(jìn)行革蘭氏染色，并繪圖、記錄染色結果。
四、注意事項
1. 涂片務(wù)求均勻，切忌過(guò)厚。
2．在染色過(guò)程中，不可使染液干涸。
3．脫色時(shí)間十分重要，過(guò)長(cháng)，則脫色過(guò)度，會(huì )使陽(yáng)性菌被染成陰性菌；脫色不夠，則會(huì )使陰性菌被染成陽(yáng)性菌。
4．老齡菌因體內核酸減少，會(huì )便陽(yáng)性菌被染成陰性菌，故不能選用。
五、實(shí)驗報吉
(一)繪圖
1．大腸桿菌革蘭氏染色視野圖。
2．金黃色葡萄球菌或蘇云金桿菌革蘭氏染色視野圖。
(二)記錄革蘭氏染色法法步驟，并進(jìn)行結果分析。
(三)未知菌的檢測結果。
六、問(wèn)題和思考
1．涂片后為什么要進(jìn)行固定?固定時(shí)應注意什么?
2．什么是革蘭氏染色法?染色過(guò)程應注意什么?
3．試分析革蘭氏染色法在細菌分類(lèi)中的意義。
  
   

 

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