噬菌體效價(jià)的測定

目的

1．學(xué)習并掌握噬菌體效價(jià)的含義及其測定原理。

2．學(xué)習并掌握雙層瓊脂平板法測定噬菌體效價(jià)。

原理

噬菌體屬于細菌病毒，它不具備完整的細胞結構，只能通過(guò)寄主細胞完成自我復制。因此人類(lèi)只有通過(guò)電子顯微鏡才可觀(guān)察到它們的形態(tài)結構。但是，由于噬菌體侵染細菌細胞后，可導致寄主細胞溶解死亡，并在瓊脂培養基表面形成空斑-噬菌斑（Plaque），所以人們可以此來(lái)判斷噬菌體的存在。

噬菌體的效價(jià)即：每毫升培養液中含有具感染性噬菌體的數量。它的測定常用雙層瓊脂平板法。由此法得到的噬菌斑形態(tài)、大小較一致，且清晰度高，計算準確。該方法首先在無(wú)菌培養皿內倒入營(yíng)養瓊脂作為底層，然后將適當稀釋的噬菌體與培養至對數期的受體菌混合，保溫吸附后，加入冷卻至45℃左右的半固體瓊脂糖，迅速混勻后鋪平板，作為上層, 最后倒置培養。只要噬菌體具有感染力就可形成噬菌斑。根據不同稀釋度平板上出現的噬菌斑數目，即可算出原液噬菌體的效價(jià)。

公式為： 噬菌斑形成單位（pfu/ml）= 噬菌斑數×稀釋倍數×10

本實(shí)驗選擇的λ 噬菌體EA94， 是一被改造的烈性噬菌體。

材料

1．菌種：大腸桿菌（Escherichia coli）LE392

2．噬菌體：λ 噬菌體EA94

3．培養基：300 ml 三角瓶中分裝100ml LB 培養基，300 ml 三角瓶中分裝150 ml LB 固體培養基，15×150mm 試管分裝3.5 ml 0.7%瓊脂糖。

4．滅菌物品：20%麥芽糖，1mol/L MgSO4，10 mmol/L MgSO4，18×180mm 試管分裝9 ml和20 ml 噬菌體緩沖液（20 mmol/L Tris pH 7.4，100 mmol/L NaCl，10 mmol/L MgSO4），100ml 離心管，100μl 槍頭，微離心管，培養皿。

5．儀器：取樣器，恒溫水浴鍋，恒溫培養箱，臺式離心機。

方法

1．制底層平板：將融化并冷卻至45℃左右的LB 培養基倒入無(wú)菌培養皿，每皿約10-12 ml，共9 皿， 水平放置，凝固后，作好稀釋度標記備用；

2．制備噬菌體稀釋液：取20μL 噬菌體原液于19.98 ml 緩沖液中得到1000 倍（10－3）稀釋液。再取1 ml 10－3 稀釋液于9 ml 緩沖液中得到10－4 稀釋液，依次類(lèi)推直至10－7 稀釋液，并在試管上作好相應標記備用；

3．制備受體菌細胞：將活化的大腸桿菌接種于50ml 牛肉膏蛋白胨培養液（內含0.5ml 20%麥芽糖和0.5ml 1mol/L MgSO4）中，經(jīng)過(guò)夜培養后，離心收集菌體細胞，然后懸浮于20 ml 10mmol/L MgSO4.7H2O 中，備用；

4．吸附：用取樣器分別取100μl 10－5、10－6、10－7 噬菌體稀釋液和100μl 受體菌細胞液，充分混和后置于37℃恒溫箱中保溫25 分鐘，并在微離心管上作好相應標記；

5．制上層平板：用取樣器分別取出全部混合液加入到冷卻至45℃左右的0.7%瓊脂糖中，迅速混勻后，倒在有相應標記的底層平板上，邊倒邊在臺面上搖勻，使上層培養基迅速鋪滿(mǎn)整個(gè)平皿；

6．培養：37℃倒置培養15-18 小時(shí)后，檢查結果。

結果

記錄平板上出現的噬菌斑數，并計算噬菌體原液的效價(jià)。

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