試驗方法-細菌回復突變試驗

7  試驗方法
7．1  總則
    常用的試驗方法有平板摻入法、預培養平板摻人法和點(diǎn)試法等。
7．2平板摻入法
7．2．1  將主平板或冷凍保存的菌株培養物接種于營(yíng)養肉湯培養基內，37℃振蕩(100次／min)培養10 h或靜置培養16 h，使活菌數不少于1×10⁹ ／mL～2×10⁹／mL。
7．2．2底層培養基平板，每個(gè)劑量加S9和不加S9均做3個(gè)平板。
7．2．3融化頂層培養基分裝于無(wú)菌帶帽小試管(試管數與平板數相同)，每管2 mL，在45℃水浴中保溫。
7．2．4在保溫的頂層培養基(試管)中依次加入測試菌株新鮮增菌液0.1 mL，混勻；試驗組加受試物0.0.5mL～0．2 mL(一般加入

0.1mL，需活化時(shí)另加10％S9混合液0．5 mL)，再混勻，迅速傾人鋪好底層培養基的平板上，轉動(dòng)平板使頂層培養基均勻分布在底

層培養基上，平放固化；37℃培養48 h觀(guān)察結果，必要時(shí)延長(cháng)至72 h觀(guān)察結果。
7．2．5  陽(yáng)性對照組加入同體積標準誘變劑；溶媒對照組只加入同體積的溶媒；未處理對照組只在培養基上加菌液；其他方法同

試驗組。
7．3預培養平板摻入法
    預培養對于某些受試物可取得較好效果。因此可根據情況確定是否進(jìn)行預培養。在加入頂層培養基前，先進(jìn)行以下預培養步驟：
    a)  將受試物(需活化時(shí)另加10％S9混合液0．5 mL)和菌液，在37℃中培養20 min，或在30℃中培養30 min；
    b)再加入2 mL頂層瓊脂；
    其他同7．2。
7．4  點(diǎn)試法
7．4．1  按7．2．1操作。
7．4．2按7．2．2操作。
7．4．3按7．2．3操作。
7．4．4  在水浴保溫的頂層培養基中依次加入測試增菌液0.1 mL(需活化時(shí)另加10％S9混合液o．5 mL)，混勻，迅速傾入底層培養基上，轉動(dòng)平板，使頂層培養基在底層分布均勻。平放固化后取無(wú)菌濾紙片(直徑約為6 mm)，小心放在已固化的頂層培養基的適當位置上，用移液器取適量受試物(如10μL)，點(diǎn)在紙片上，或將少量固體受試物結晶加到紙片或瓊脂表面；37℃培養48 h觀(guān)察結果。
7．4．5另作陽(yáng)性對照組和溶媒對照組，分別在濾紙片上加人同體積標準誘變劑、溶媒，未處理對照組濾 紙片上不加物質(zhì)，其他

步驟同上。

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