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5．1 試驗菌株
推薦采用下列的菌株組合
a) 鼠傷寒沙門(mén)氏菌TAl535；
b) 鼠傷寒沙門(mén)氏菌TA97a或TA97或TAl537；
c) 鼠傷寒沙門(mén)氏菌TA98；
d) 鼠傷寒沙門(mén)氏菌TAl00；
e) 鼠傷寒沙門(mén)氏菌TAl02或大腸桿菌WP2uvrA或大腸桿菌WP2uvrA(PKMl01)。
5．2菌株的鑒定
5．2．1 總則
菌株特性應與回復突變試驗標準相符。菌株的鑒定包括：基因型鑒定、白發(fā)回變數鑒定和對陽(yáng)性致
突變物敏感性的鑒定。
每3個(gè)月進(jìn)行一次菌株鑒定，遇到下列情況也應進(jìn)行菌株鑒定：
a)在收到培養菌株后；
b) 當制備一套新的冷凍保存或冰凍干燥菌株時(shí)；
c)重新挑選菌株時(shí)；
d)使用主平板傳代時(shí)。
5．2．2 鑒定方法
5．2．2．1 增菌培養
在5 mL營(yíng)養肉湯培養基中用接種環(huán)接種貯存菌培養物，37℃振蕩(100次／min)培養10 h或靜置
培養16 h，使活菌數不少于1×109／mL～2×109／mL。
5．2．2．2組氨酸缺陷型(his)的鑒定
5．2．2．2．1 底層培養皿的制備
加熱融化底層培養基兩瓶。一瓶不加組氨酸，每100 mL底層培養基中加0.5mmol D-生物素
0.6 mL；另一瓶加組氨酸，每100 mL底層培養基中加L-組氨酸l mL和O．5 mmol D-生物素0.6mL。
冷卻至50℃左右，每種底層培養基各倒兩個(gè)平板。
5．2．2．2．2 接種
取有組氨酸和無(wú)組氨酸培養基平板各一個(gè)，按菌株號順序各取一接種環(huán)的菌液劃直線(xiàn)于培養基表
面，37℃培養48 h。
5．2．2．2．3 結果判定
株菌在有組氨酸培養基平板表面各長(cháng)出一條菌膜，在無(wú)組氨酸培養基平板上除白發(fā)回變菌落外無(wú)
菌膜，說(shuō)明受試菌株確為組氨酸缺陷型。
5．2．2．3脂多糖屏障缺陷(rfa)的鑒定
5．2．2．3．1 接種
加熱融化營(yíng)養肉湯瓊脂培養基。取菌液0.1mL移人平板，迅速將營(yíng)養肉湯瓊脂培養基(冷卻至
50℃左右)適量倒入平板，混勻，平放凝固。將無(wú)菌濾紙片一片放入已凝固的培養基平板中央，用移液
器在濾紙片上滴加0.1％結晶紫溶液10μL，37℃培養24 h，每個(gè)菌株做一個(gè)平板。
5．2．2．3．2 結果判定
陽(yáng)性者在紙片周?chē)霈F一個(gè)透明的抑制帶，說(shuō)明存在rfa突變。這種變化允許某些大分子物質(zhì)進(jìn)
入細菌體內并抑制其生長(cháng)。
5．2．2．4 R因子(抗氨芐青霉素)的鑒定
5．2．2．4．1 接種
加熱融化營(yíng)養肉湯瓊脂培養基，冷卻到50℃左右，適量倒入平板中，平放凝固，用移液器吸o．8％的
氨芐青霉素10肛L，在凝固的培養基表面沿中線(xiàn)涂成一條帶，待氨芐青霉素溶液干后，用接種環(huán)取各菌
株菌液與氨芐青霉素帶相交叉劃線(xiàn)接種，并且接種一個(gè)不具有R因子的菌株作氨芐青霉素抗性的對
照，37℃培養24 h，一個(gè)平板可同時(shí)鑒定幾個(gè)菌株。
5．2．2．4．2 結果判定
菌株在氨芐青霉素帶的周?chē)廊簧L(cháng)不受抑制，即有抗氨芐青霉素效應，證明它們都帶有R因子。
5．2．2．5 四環(huán)素抗性的鑒定
5．2．2．5．1 接種
用移液器各吸取5弘L～10肛L o．8％的四環(huán)素溶液和o．8％的氨芐青霉素溶液，在營(yíng)養肉湯瓊脂培
養基平板表面沿中線(xiàn)涂成一條帶，待四環(huán)素和氨芐青霉素溶液干后，用接種環(huán)取各菌株菌液與四環(huán)素和
氨芐青霉素帶相交叉劃線(xiàn)接種TAl02和一種有R因子的菌株(作四環(huán)素抗性的對照)，37℃培養24 h。
5．2．2．5．2 結果判定
TAl02菌株生長(cháng)不受抑制，對照菌株有一段生長(cháng)抑制區，表明TAl02菌株有抗四環(huán)素效應。
5．2．2．6 uvrB修復缺陷型的鑒定
5．2．2．6．1 接種
在營(yíng)養肉湯瓊脂培養基平板表面用接種環(huán)劃線(xiàn)接種需要的菌株。接種后的平板一半用墨紙覆蓋，
在距15 W紫外線(xiàn)滅菌燈33 cm處照射8 s，37℃培養24 h。
5．2．2．6．2 結果判定
對紫外線(xiàn)敏感的三個(gè)菌株(TA97、TA98、TAl00)僅在沒(méi)有照射過(guò)的一半生長(cháng)，具有野生型切除修
復酶的菌株TAl02仍能生長(cháng)。
5．2．2．7 生物素缺陷型(bio)的鑒定
5．2．2．7．1 底層培養皿的制備
加熱融化底層培養基兩瓶。一瓶加生物素，每100 mL底層培養基中加0．5 mm01 D生物素O．6 mL
和L組氨酸1 mL；另一瓶不加生物素，每100 mL底層培養基中加L組氨酸1 mL，冷卻至50℃左右，
每種底層培養基各倒兩個(gè)平板。
5．2．2．7．2 接種
取有生物素和無(wú)生物素培養基平板各一個(gè)，按菌株號順序各取一接種環(huán)的菌液劃直線(xiàn)于培養基表
面，37℃培養48 h。
GB 151 93．4—201 4
5．2．2．7．3 結果判定
株菌在有生物素培養基平板表面各長(cháng)m一條菌膜，在無(wú)生物素培養基平板上除白發(fā)回變菌落外無(wú)
菌膜，說(shuō)明受試菌株確為生物素缺陷型。
5．2．2．8 自發(fā)回變率的測定
5．2．2．8．1 測定方法
準備底層培養基平板8個(gè)。融化頂層培養基8管，每管2 mL，在45℃水浴中保溫。在每管頂層培
養基中，分別加入待鑒定的測試菌株的菌液o．1 mL，一式兩份，輕輕搖勻，迅速將此試管內容物倒人已
固化的底層培養基平板中，轉動(dòng)平板，使頂層培養基均勻分布，平放固化，37℃培養48 h，計數菌落數。
5．2．2．8．2 結果判定
每一株的自發(fā)回變率應落在表A．3所列的正常范圍內。
5．3菌株的保存
鑒定合格的菌株應保存在深低溫(如一80℃)，或加人9％光譜級DMSO作為冷凍保護劑保存在液
氮條件下( 196℃)。無(wú)上述條件者可冰凍干燥制成干粉，4℃保存。除液氮條件外，保存期一般不超
過(guò)2年。主平板貯存于4℃，超過(guò)2個(gè)月后應丟棄(TAl02除外，保存2周后丟棄)。
