細菌回復突變試驗儀器和試劑（二）-GB 15193．4—2014

4.2.6  陽(yáng)性誘變劑的配制
    根據所選擇的誘變劑的種類(lèi)和劑量用適當的溶媒配制陽(yáng)性對照品(見(jiàn)附錄B、附錄C)。
    注：培養基成分或試劑除特殊說(shuō)明外至少應是化學(xué)純，無(wú)誘變性。避免重復高溫處理，選擇適當保存溫度和期限。
4.3 10％S9混合液的制備
4.3.1 S9輔助因子的配制
4.3.1.1  鎂鉀溶液
    氯化鎂1．9 g和氯化鉀6．15 g加蒸餾水溶解至100 mL。

4.3.1.2 磷酸鹽緩沖液(0.2mol／L)(pH7．4)
    磷酸氫二鈉(28．4 g／L)    440 mL
    磷酸二氫鈉(27．6 g／L)  60 mL
    調pH至7.4，0.103 MPa滅菌20 min或濾菌。
4.3.1.3 輔酶-Ⅱ(氧化型)溶液
    無(wú)菌條件下稱(chēng)取輔酶Ⅱ，用無(wú)菌蒸餾水溶解配制成溶液(0.025mol／L)，現用現配。
4.3.1.4 葡萄糖-6-磷酸鈉鹽溶液
    無(wú)菌條件下稱(chēng)取葡萄糖-6-磷酸鈉鹽，用無(wú)菌蒸餾水溶解配制成溶液(0.05 mol／L)，現用現配。
4.3.2  大鼠肝S9組分的誘導和配制
    選健康雄性成年SD或Wistar大鼠，體重150g～200g，周齡約5周～6周。將多氯聯(lián)苯
(Aroclorl254)溶于玉米油中，濃度為200 g／L。，按500mg／kg體重無(wú)菌操作一次腹腔注射，5d后處死
動(dòng)物，處死前禁食12h。
    也可采用苯巴比妥鈉和β-萘黃酮聯(lián)合誘導的方法進(jìn)行制備，經(jīng)口灌胃給予大鼠苯巴比妥鈉和β萘
黃酮，劑量均為80 mg／kg，連續3d，禁食16 h后斷頭處死動(dòng)物。其他操作同多氯聯(lián)苯誘導。
    處死動(dòng)物后取出肝臟，稱(chēng)重后用新鮮冰冷的氯化鉀溶液(0.15 mol／L)連續沖洗肝臟數次，以
便除去能抑制微粒體酶活性的血紅蛋白。每克肝(濕重)加氯化鉀溶液0.1mol／L)3 mL，連同燒杯
移入冰浴中，用無(wú)菌剪刀剪碎肝臟，在玻璃勻漿器(低于4000 r／min，1min～2 min)或組織勻漿器(低
于20000 r／min，1min)中制成肝勻漿。以上操作需注意無(wú)菌和局部冷環(huán)境。
    將制成的肝勻漿在低溫(0℃～4℃)高速離心機上以9000g離心10 min，吸m上清液為S9組分，
分裝于無(wú)菌冷凍管或安瓿中，每安瓿2 mL左右，用液氮或干冰速凍后置80℃低溫保存。
    S9組分制成后，經(jīng)無(wú)菌檢查，測定蛋白含量(Lowry法)，每毫升蛋白含量不超過(guò)40mg為宜，并經(jīng)
間接致癌物(誘變劑)鑒定其生物活性合格后貯存于深低溫或冰凍干燥，保存期不超過(guò)1年。
4.3.3  10％S9混合液的制備
    10％S9混合液一般由S9組分和輔助因子按1：9組成，也可將濃度配制成30％(不同受試物所需
S9濃度不同)，臨用時(shí)新鮮無(wú)菌配制，或過(guò)濾除菌。10％S9混合液10 mL配制如下：
    磷酸鹽緩沖液    6．0mL
    鎂鉀溶液    0．4mL
    葡萄糖-6-磷酸鈉鹽溶液    1．0 mL
    輔酶Ⅱ溶液    1．6 mL
    肝S9組分    1．0 mL
    混勻，置冰浴中待用。
    用每平板0.5 mL S9混合液(含20μL～50μL S9)測定其對已知陽(yáng)性致癌物(誘變劑)的生物活性，
確定最適用量。也可按一般用量，即每平皿0.5 mL S9混合液。

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