土壤的稀釋分離、純化微生物及無(wú)菌操作技術(shù)

 一、實(shí)驗目的和內容
目的：學(xué)習從土壤中分離微生物的方法，學(xué)習無(wú)菌操作技術(shù)。
內容：
l．用稀釋法分離細菌、放線(xiàn)菌和霉菌。
2．用平板劃線(xiàn)方法分離微生物。
3．學(xué)習斜面接種及穿刺接種等無(wú)菌操作技術(shù)。
二、實(shí)驗材料和用具
金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和普通變形菌(Proteus vulgaris)斜面菌種。
已滅菌的牛肉膏、高氏1號、土豆蔗糖固體培養基各1瓶，49.5mL無(wú)菌水(帶玻璃珠)1瓶，4.5mL無(wú)菌水6管，80%乳酸，10%酚液，95%乙醇。
無(wú)菌培養皿12套，1mL無(wú)菌移液管10支，土壤樣品及天平、稱(chēng)量紙、藥勺、試管架、玻璃鉛筆、橡皮頭(用75%乙醇浸泡)、玻璃刮。
三、操作步驟
(一)土壤稀釋分離
1．取土壤  取表層以下5—10cm處的土樣，放入無(wú)菌的袋中備用，或放在4℃冰箱中暫存。
2．制備稀釋液(要無(wú)菌操作)
(1)制備土壤懸液：稱(chēng)土樣0.5g，迅速倒入帶玻璃珠的49.5mL無(wú)菌水瓶中(玻璃珠用量以充滿(mǎn)瓶底力最好)，振蕩5～10min，使土樣充分打散，即成為10-2的土壤懸液。
(2)稀釋?zhuān)河脽o(wú)菌移液管吸10-2的土壤懸液0.5mL，放入4.5mL無(wú)菌水中即為10-3稀釋液，如此重復，可依次制成10-3～10-8的稀釋液(圖3-1)。注意：操作時(shí)管尖不能接觸液面，每一個(gè)稀釋度換用一支移液管，每次吸入土液后，要將移液管插入液面，吹吸3次，每次吸上的液面要高于前一次，以減少稀釋中的誤差。
3. 混菌法測定菌落數的方法
(1)細菌：取10-7、10-6兩管稀釋液各1mL，分別接人相應標號的平皿中，每個(gè)稀釋度接兩個(gè)平皿。然后取冷卻至50℃的牛肉膏瓊脂培養基，分別倒入以上培養皿中(裝量以鋪滿(mǎn)皿底高1.5～2mm為宜)，迅速輕輕搖動(dòng)平皿，使菌液與培養基充分混勻，但不沾濕皿的邊緣，待瓊脂凝固即成細菌平板。倒平板時(shí)要注意無(wú)菌操作，見(jiàn)圖3-2。
  
 
 
 
 
 
 
 
 


圖3—2  倒平板的方法
（2）放線(xiàn)菌：取10-5、10-4兩管稀釋液，在每管中加入10%酚液5～6滴，搖勻，靜置片刻，然后分別從兩管中吸出1mL加入相應標號的平皿中，選用高氏1號培養基，用與細菌相同的方法倒入平皿中，便可制成放線(xiàn)菌平板。
（3）霉菌：取10-2、10-3兩管稀釋各1mL，分別接入相應標號的平皿中，每個(gè)稀釋度接兩個(gè)平皿。在融化的土豆蔗糖培養基中，每100mL加入滅菌的乳酸1mL，輕輕搖勻，然后用與細菌相同的方法倒入平皿中，便可制成霉菌的平板。
4．培養  將接種好的細菌、放線(xiàn)菌、霉菌平板倒置，即皿蓋朝下放置，于28～30℃中恒溫培養，細菌培養1～2d，放線(xiàn)菌培養5～7d，霉菌培養3～5d。觀(guān)察生長(cháng)的菌落，用于進(jìn)一步純化分離或直接轉接斜面。
（二）平板制作及劃線(xiàn)分離方法。
1．倒平板  按無(wú)菌操作要求，在火焰旁操作（圖3—2），做法如3（1）。
2．劃線(xiàn)分離  使用接種環(huán)，從待純化的菌落或待分離的斜面菌種只沾取少量菌樣，在相應培養基平板中劃線(xiàn)分離，劃線(xiàn)的方法多樣，目的是獲得單個(gè)菌落，主要方法參見(jiàn)圖3—3。
（三）斜面接種和穿刺接種
1．斜面接種
（1）取新鮮固體斜面培養基，分別做好標記（寫(xiě)上菌名、接種日期、接種人等），然后用無(wú)菌操作方法，把待接菌種接入以上新鮮培養基斜面上。
（2）接種的方法是，用接種環(huán)沾取少量待接菌種，然后在新鮮斜面上“之”字形劃線(xiàn)，方向是從下部開(kāi)始，一直劃至上部（圖3—4A）。注意劃線(xiàn)要輕，不可把培養基劃破。
（3）接種后30℃ 恒溫培養，細菌培養48h，放線(xiàn)菌、霉菌培養至孢子成熟方可取出保存。
2．穿刺接種
（1）取兩支新鮮半固體牛肉膏蛋白胨柱狀培養基，做好標記（寫(xiě)上菌名）、接種日期，接種人等）。
（2）接種的方法是，用接種針沾取少量待接菌種，然后從柱狀培養基的中心穿入其底部（但不要穿透），然后沿原刺入路線(xiàn)抽出接種針，注意接種針不要移動(dòng)。
（3）接種后30℃恒溫培養， 24h后觀(guān)察，比較兩種菌的生長(cháng)結果。
四、注意事項
1．一般土壤中，細菌最多，放線(xiàn)菌及霉菌次之，而酵母菌主要見(jiàn)于果園及菜園土壤中，故從土壤中分離細菌時(shí)，要取較高的稀釋度，否則菌落連成一片不能計數。
2．在土壤稀釋分離操作中，每稀釋10倍，最好更換一次移液管，使計數準確。
3．放線(xiàn)菌的培養時(shí)間較長(cháng)，故制平板的培養基用量可適當增多。
五、實(shí)驗報告
1．記錄土壤稀釋分離結果，并計算出每克土壤中的細菌、放線(xiàn)菌和霉菌的數量。
計算方法：選擇長(cháng)出菌落數30～300之間的培養皿進(jìn)行計數，按以下公式：
總菌數/g=同一稀釋度幾次重復的菌落平均數×稀釋倍數
2．分別記錄平板劃線(xiàn)、斜面接種的結果，并自我評價(jià)。
3．比較兩種細菌穿刺接種的結果，并進(jìn)行分析。
七、問(wèn)題和思考
1．在測定土壤微生物含量中，除混菌法外還可用什么方法?
2．試設計實(shí)驗，從土壤中分離出酵母菌，并進(jìn)行計數。
  
   

 

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