嗜熱脂肪芽孢桿菌抑制法原理與程序

原理：培養基預先混合嗜熱脂肪芽孢桿菌芽孢，并含有 pH 指示劑（溴甲酚紫）。加入樣品并溫浴后，若該樣品中不含有抗生素或抗生素的濃度低于檢測限，細菌芽孢將在培養基中生長(cháng)并利用糖產(chǎn)酸，pH 指示劑的紫色變?yōu)辄S色。相反，如果樣品中含有高于檢測限的抗生素，則細菌芽孢不會(huì )生長(cháng)，pH 指示劑的顏色保持不變，仍為紫色。

芽孢懸液：將嗜熱脂肪芽孢桿菌菌種劃線(xiàn)移種于營(yíng)養瓊脂平板表面，56 ℃培養 24 h 后挑取乳白色半透明圓形特征菌落，在營(yíng)養瓊脂平板上再次劃線(xiàn)培養，56 ℃培養24 h 后轉入 36 ℃培養 3 d～4 d，鏡檢芽孢產(chǎn)率達到 95%以上時(shí)進(jìn)行芽孢懸液的制備。每 塊平板用 1 mL～3 mL無(wú)菌磷酸鹽緩沖液洗脫培養基表面的菌苔（如果使用克氏瓶，每瓶使用無(wú)菌磷酸鹽緩沖液 10 mL～20 mL）。將洗脫液 5 000 r/min離心 15 min。取沉淀物加無(wú)菌0.03 mol/L 磷酸鹽緩沖液（pH 7.2）制成 10 ９ cfu/mL 芽孢懸液，置 80 ℃恒溫水浴中 10 min 后，密封防止水分蒸發(fā)，置冰箱保存備用。

測試培養基：在溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨培養基中加入適量芽孢懸液，混合均勻，使最終的芽孢濃度為 8×10 ５ ～2×10 ６ cfu/mL�；旌涎挎邞乙旱匿寮追幼掀咸烟堑鞍纂伺囵B基分裝小試管，每管 200 μL，密封防止水分蒸發(fā)。這樣配制好的測試培養基可以在冰箱保存 6 個(gè)月。

培養操作：吸 取樣品100 μL加入含有芽孢的測試培養基中，輕 輕旋轉試管混勻。每 份檢樣作二份，另外再作陰性和陽(yáng)性對照各一份，陽(yáng)性對照管為 100 μL 青霉素 G 參照溶液，陰性對照管為 100 μL 無(wú)抗生素的脫脂乳。于 65℃水浴培養 2.5 h，觀(guān)察培養基顏色的變化。如果顏色沒(méi)有變化，須再于水浴中培養 30 min 作最終觀(guān)察。

判斷方法：在白色背景前從側面和底部觀(guān)察小試管內培養基顏色。保持培養基原有的紫色為陽(yáng)性結果，培養基變成黃色或黃綠色為陰性結果，顏色處于二者之間，為可疑結果。對于可疑結果應繼續培養30 min 再進(jìn)行最終觀(guān)察。如果培養基顏色仍然處于黃色－紫色之間，表示抗生素濃度接近方法的最低檢出限，此時(shí)建議重新檢測一次。

報告:

最終觀(guān)察時(shí)，培養基依然保持原有的紫色，可以報告為抗生素殘留陽(yáng)性。

培養基變?yōu)槌庶S色或黃綠色時(shí)，可以報告為抗生素殘留陰性。

本方法檢測幾種常見(jiàn)抗生素的最低檢出限為：青霉素3 μg/L，鏈霉素 50 μg/L，慶大霉素 30 μg/L，卡那霉素 50 μg/L。

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