蠟樣芽胞桿菌檢驗培養基與試劑（GB4789.14-2014）

培養基和試劑

A.1磷酸鹽緩沖液（PBS）

A.1.2制法

貯存液：稱(chēng)取34.0 g的磷酸二氫鉀溶于500 mL蒸餾水中，用大約175 mL的1mol/L氫氧化鈉溶液調節pH至7.2，用蒸餾水稀釋至1000 mL后貯存于冰箱。

稀釋液：取貯存液1.25 mL，用蒸餾水稀釋至1000 mL，分裝于適宜容器中，121℃高壓滅菌15 min。

A.2甘露醇卵黃多黏菌素(MYP)瓊脂

A.2.2制法

將A.2.1前五種成分加入于950mL蒸餾水中，加熱溶解，校正pH至7.3±0.1，加入酚紅溶液。分裝，每瓶95mL，121℃高壓滅菌15 min。臨用時(shí)加熱溶化瓊脂，冷卻至50℃，每瓶加入50%卵黃液5 mL和濃度為10000 IU的多黏菌素B溶液1 mL，混勻后傾注平板。

A.2.2.1 50％卵黃液

取鮮雞蛋，用硬刷將蛋殼徹底洗凈，瀝干，于70%酒精溶液中浸泡30 min。用無(wú)菌操作取出卵黃，加入等量滅菌生理鹽水，混勻后備用。

A.2.2.2多黏菌素B溶液

在50 mL滅菌蒸餾水中溶解500000 IU的無(wú)菌硫酸鹽多黏菌素B。

A.3胰酪胨大豆多黏菌素肉湯

A.3.2制法

將A.3.1前五種成分加入于蒸餾水中，加熱溶解，校正pH至7.3±0.2，121℃高壓滅菌15 min。臨用時(shí)加入多黏菌素B溶液混勻即可。多黏菌素B溶液制法同附錄A.2.2.2。

A.4營(yíng)養瓊脂

A.4.2制法

將A.4.1所述成分溶解于蒸餾水內，校正pH至7.2±0.2，加熱使瓊脂溶化。121℃高壓滅菌15 min，備用。

A.5過(guò)氧化氫溶液

A.5.1試劑

3%過(guò)氧化氫溶液：臨用時(shí)配制，用H2O2配制。

A.5.2試驗方法

用細玻璃棒或一次性接種針挑取單個(gè)菌落,置于潔凈試管內，滴加3%過(guò)氧化氫溶液2mL，觀(guān)察結果。

A.5.3結果于30s內發(fā)生氣泡者為陽(yáng)性，不發(fā)生氣泡者為陰性。

A.6動(dòng)力培養基

A.6.2制法

將A.6.1所述成分于蒸餾水，校正pH至7.2±0.2，加熱溶解。分裝每管2 mL～3 mL。115℃高壓滅菌20min，備用。

A.6.3試驗方法

用接種針挑取培養物穿刺接種于動(dòng)力培養基中，30℃±1℃培養48 h±2 h。蠟樣芽胞桿菌應沿穿刺線(xiàn)呈擴散生長(cháng)，而蕈狀芽胞桿菌常常呈絨毛狀生長(cháng)，形成蜂巢狀擴散。動(dòng)力試驗也可用懸滴法檢查。蠟樣芽胞桿菌和蘇云金芽胞桿菌通常運動(dòng)極為活潑，而炭疽桿菌則不運動(dòng)。

A.7硝酸鹽肉湯

A.7.2制法

將A.7.1所述成分溶解于蒸餾水。校正pH至7.4，分裝每管5 mL，121℃高壓滅菌15 min。

A.7.3硝酸鹽還原試劑

甲液：將對氨基苯磺酸0.8 g溶解于2.5 mol/L乙酸溶液100 mL中。

乙液：將甲萘胺0.5 g溶解于2.5 mol/L乙酸溶液100 mL中。

A.7.4試驗方法

接種后在36℃±1℃培養24 h～72 h。加甲液和乙液各1滴，觀(guān)察結果，陽(yáng)性反應立即或數分鐘內顯紅色。如為陰性，可再加入鋅粉少許，如出現紅色，表示硝酸鹽未被還原，為陰性。反之，則表示硝酸鹽已被還原，為陽(yáng)性。

A.8酪蛋白瓊脂

A.8.2制法

除溴麝香草酚藍溶液外，將A.8.1所述各成分溶于蒸餾水中加熱溶解（酪蛋白不會(huì )溶解）。校正pH至7.4±0.2，加入溴麝香草酚藍溶液，121℃高壓滅菌15 min后傾注平板。

A.8.3試驗方法

用接種環(huán)挑取可疑菌落，點(diǎn)種于酪蛋白瓊脂培養基上，36℃±1℃培養48 h±2h，陽(yáng)性反應菌落周?chē)�培養基應出現澄清透明區(表示產(chǎn)生酪蛋白酶)。陰性反應時(shí)應繼續培養72 h再觀(guān)察。

A.9硫酸錳營(yíng)養瓊脂培養基

A.9.2制法

將A.9.1所述成分溶解于蒸餾水。校正pH至7.2±0.2。121℃高壓滅菌15 min，備用。

A.10 0.5%堿性復紅

A.10.1成分

堿性復紅0.5g

乙醇20.0 mL

蒸餾水80.0 mL

A.10.2制法

取堿性復紅0.5g溶解于20mL乙醇中，再用蒸餾水稀釋至100mL，濾紙過(guò)濾后儲存備用。

11動(dòng)力培養基

A.11.1成分

蛋白胨10.0 g

牛肉浸粉3.0g

瓊脂4.0g

A.11.2制法

將A.11.1所述成分溶解于蒸餾水。校正pH至7.2±0.2，分裝小試管，121℃高壓滅菌15 min，備用。

A.12糖發(fā)酵管

12.2制法

A.12.2.1糖發(fā)酵管按A.12.1所述成分配好后，校正pH至7.2±0.2，按0.5 %加入葡萄糖，分裝于一個(gè)有倒置小管的小試管內，115℃高壓滅菌15 min。

A.12.2.2其他各種糖發(fā)酵管可按A.12.1所述成分配好后，分裝每瓶100 mL，115℃高壓滅菌15 min。另將各種糖類(lèi)分別配好10 %溶液，同時(shí)115℃高壓滅菌15 min。將5 mL糖溶液加入于100 mL培養基內，以無(wú)菌操作分裝小試管。

注：蔗糖不純，加熱后會(huì )自行水解者，應采用過(guò)濾法除菌。

A.12.3試驗方法

挑取可疑菌落接種于葡萄糖發(fā)酵管中，厭氧條件下36℃±1℃培養24 h±2 h。培養基由紅色變?yōu)辄S色者表明該菌在厭氧條件下能發(fā)酵葡萄糖。

A.13 V-P培養基

A.13.2制法

將A.13.1所述成分溶解于蒸餾水。校正pH至7.0±0.2，分裝每管1 mL。115℃高壓滅菌20min，備用。

A.13.3試驗方法

用營(yíng)養瓊脂培養物接種于本培養基中，36℃±1℃培養48 h～72 h。加入6 %α-萘酚-乙醇溶液0.5 mL和40 %氫氧化鉀溶液0.2 mL，充分振搖試管，觀(guān)察結果，陽(yáng)性反應立即或于數分鐘內出現紅色。如為陰性，應放在36℃±1℃培養4 h再觀(guān)察。

A.14胰酪胨大豆羊血(TSSB)瓊脂

A.14.2制法

將A.14.1所述各成分于蒸餾水中加熱溶解。校正pH至7.2±0.2，分裝每瓶100 mL。121℃高壓滅菌15 min。水浴中冷卻至45℃～50℃，毎100mL加入5～10mL無(wú)菌脫纖維羊血，混勻后傾注平板。

A.15溶菌酶營(yíng)養肉湯

A.15.2制法

除溶菌酶溶液外，將A.15.1所述成分溶解于蒸餾水。校正pH至6.8±0.1，分裝每瓶99 mL。121℃高壓滅菌15 min。每瓶加入0.1 %溶菌酶溶液1 mL，混勻后分裝滅菌試管，每管2.5 mL。0.1%溶菌酶溶液配制：在65 mL滅菌的0.1 mol/L鹽酸中加入0.1 g溶菌酶，隔水煮沸20 min溶解后，再用滅菌的0.1 mol/L鹽酸稀釋至100 mL�；蛘叻Q(chēng)取0.1 g溶菌酶溶于100 mL的無(wú)菌蒸餾水后，用孔徑為0.45 μm硝酸纖維膜過(guò)濾。使用前測試是否無(wú)菌。

A.15.3試驗方法

用接種環(huán)取純菌懸液一環(huán)，接種于溶菌酶肉湯中，36℃±1℃培養24 h。蠟樣芽胞桿菌在本培養基(含0.001％溶菌酶)中能生長(cháng)。如出現陰性反應，應繼續培養24 h。

A.16西蒙氏檸檬酸鹽培養基

A.16.2制法

除溴麝香草酚藍溶液和瓊脂外，將A.16.1所述各成分溶解于1000.0 mL蒸餾水內，校正pH至6.8，再加瓊脂，加熱溶化。然后加入溴麝香草酚藍溶液，混合均勻后分裝試管，121℃高壓滅菌15 min。制成斜面。

A.16.3試驗方法

挑取少量瓊脂培養物接種于西蒙氏檸檬酸培養基，36℃±1℃培養4d。每天觀(guān)察結果，陽(yáng)性者斜面上有菌落生長(cháng)，培養基從綠色轉為藍色。

A.17明膠培養基

A.17.1成分

蛋白胨5.0 g

牛肉粉3.0 g

明膠120.0 g

蒸餾水1 000.0 mL

A.17.2制法

將A.17.1所述成分混合，置流動(dòng)蒸汽滅菌器內，加熱溶解，校正pH至7.4～7.6，過(guò)濾。分裝試管，121℃高壓滅菌10 min，備用。

A.17.3試驗方法

挑取可疑菌落接種于明膠培養基，36℃±1℃培養24h±2h，取出，2℃～8℃放置30 min，取出，觀(guān)察明膠液化情況。

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