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蠟樣芽胞桿菌平板計數法（第一法）
4.2操作步驟
4.2.1樣品處理
冷凍樣品應在45 ℃以下不超過(guò)15 min或在2 ℃～5 ℃不超過(guò)18 h解凍，若不能及時(shí)檢驗，應放于-10℃~ -20℃保存；非冷凍而易腐的樣品應盡可能及時(shí)檢驗，若不能及時(shí)檢驗，應置于2 ℃～5 ℃冰箱保存，24 h內檢驗。
4.2.2樣品制備
稱(chēng)取樣品25 g，放入盛有225 mL PBS或生理鹽水的無(wú)菌均質(zhì)杯內，用旋轉刀片式均質(zhì)器以8000 r/min～10000 r/min均質(zhì)1 min～2 min，或放入盛有225 mL PBS或生理鹽水的無(wú)菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1 min～2 min。若樣品為液態(tài)，吸取25 mL 樣品至盛有225 mL PBS或生理鹽水的無(wú)菌錐形瓶(瓶?jì)瓤深A置適當數量的無(wú)菌玻璃珠)中，振蕩混勻，作為1:10的樣品勻液。
4.2.3樣品的稀釋
吸取4.2.2中1:10的樣品勻液1 mL加到裝有9mL PBS或生理鹽水的稀釋管中，充分混勻制成1:100的樣品勻液。跟據對樣品污染狀況的估計，按上述操作，依次制成十倍遞增系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋1次，換用1支1mL無(wú)菌吸管或吸頭。
4.2.4樣品接種
根據對樣品污染狀況的估計，選擇2個(gè)～3個(gè)適宜稀釋度的樣品勻液（液體樣品可包括原液），以0.3 mL、0.3 mL、0.4 mL 接種量分別移入三塊MYP瓊脂平板，然后用無(wú)菌L棒涂布整個(gè)平板，注意不要觸及平板邊緣。使用前，如MYP瓊脂平板表面有水珠，可放在25 ℃～50 ℃的培養箱里干燥，直到平板表面的水珠消失。
4.2.5分離、培養
4.2.5.1 分離
在通常情況下，涂布后，將平板靜置10 min。如樣液不易吸收，可將平板放在培養箱30 ℃±1℃培養1 h，等樣品勻液吸收后翻轉平皿，倒置于培養箱，30 ℃±1 ℃培養24 h±2 h。如果菌落不典型，可繼續培養24 h±2 h再觀(guān)察。在MYP瓊脂平板上，典型菌落為微粉紅色(表示不發(fā)酵甘露醇)，周?chē)邪咨恋奂t色沉淀環(huán)（表示產(chǎn)卵磷脂酶）。
4.2.5.2純培養
從每個(gè)平板（符合4.4.1.1要求的平板）中挑取至少5個(gè)典型菌落（小于5個(gè)全選），分別劃線(xiàn)接種于營(yíng)養瓊脂平板做純培養，30 ℃±1 ℃培養24 h±2 h，進(jìn)行確證實(shí)驗。在營(yíng)養瓊脂平板上，典型菌落為灰白色，偶有黃綠色，不透明，表面粗糙似毛玻璃狀或融蠟狀，邊緣常呈擴展狀，直徑為4 mm～10 mm。
4.3確定鑒定
4.3.1染色鏡檢
挑取純培養的單個(gè)菌落，革蘭氏染色鏡檢。蠟樣芽胞桿菌為革蘭氏陽(yáng)性芽胞桿菌，大小為（1μm～1.3μm）×（3μm～5μm），芽胞呈橢圓形位于菌體中央或偏端，不膨大于菌體，菌體兩端較平整，多呈短鏈或長(cháng)鏈狀排列。
4.3.2生化鑒定
4.3.2.1 概述
挑取純培養的單個(gè)菌落，進(jìn)行過(guò)氧化氫酶試驗、動(dòng)力試驗、硝酸鹽還原試驗、酪蛋白分解試驗、溶菌酶耐性試驗、V-P試驗、葡萄糖利用(厭氧)試驗、根狀生長(cháng)試驗、溶血試驗、蛋白質(zhì)毒素結晶試驗。蠟樣芽胞桿菌生化特征與其他芽胞桿菌的區別見(jiàn)表1。
4.3.2.2動(dòng)力試驗
用接種針挑取培養物穿刺接種于動(dòng)力培養基中，30℃培養24h。有動(dòng)力的蠟樣芽胞桿菌應沿穿刺線(xiàn)呈擴散生長(cháng)，而蕈狀芽孢桿菌常呈“絨毛狀”生長(cháng)。也可用懸滴法檢查。
4.3.2.3溶血試驗
挑取純培養的單個(gè)可疑菌落接種于TSSB瓊脂平板上，30 ℃±1 ℃培養24 h±2 h。蠟樣芽胞桿菌菌落為淺灰色，不透明，似白色毛玻璃狀，有草綠色溶血環(huán)或完全溶血環(huán)。蘇云金芽胞桿菌和蕈狀芽胞桿菌呈現弱的溶血現象，而多數炭疽芽胞桿菌為不溶血，巨大芽胞桿菌為不溶血。
4.3.2.4根狀生長(cháng)試驗
挑取單個(gè)可疑菌落按間隔2cm～3cm左右距離劃平行直線(xiàn)于經(jīng)室溫干燥1d～2d的營(yíng)養瓊脂平板上，30 ℃±1 ℃培養24 h～48h，不能超過(guò)72h。用蠟樣芽胞桿菌和蕈狀芽胞桿菌標準株作為對照進(jìn)行同步試驗。蕈狀芽胞桿菌呈根狀生長(cháng)的特征。蠟樣芽胞桿菌菌株呈粗糙山谷狀生長(cháng)的特征。
4.3.2.5溶菌酶耐性試驗
用接種環(huán)取純菌懸液一環(huán)，接種于溶菌酶肉湯中，36 ℃±1 ℃培養24 h。蠟樣芽胞桿菌在本培養基（含0.001%溶菌酶）中能生長(cháng)。如出現陰性反應，應繼續培養24 h。巨大芽胞桿菌不生長(cháng)。
4.3.2.6蛋白質(zhì)毒素結晶試驗
挑取純培養的單個(gè)可疑菌落接種于硫酸錳營(yíng)養瓊脂平板上，30 ℃±1 ℃培養24 h±2 h，并于室溫放置3 d～4 d，挑取培養物少許于載玻片上，滴加蒸餾水混勻并涂成薄膜。經(jīng)自然干燥，微火固定后，加甲醇作用30 s后傾去，再通過(guò)火焰干燥，于載玻片上滴滿(mǎn)0.5%堿性復紅，放火焰上加熱（微見(jiàn)蒸氣，勿使染液沸騰)持續1 min～2 min，移去火焰，再更換染色液再次加溫染色30 s，傾去染液用潔凈自來(lái)水徹底清洗、晾干后鏡檢。觀(guān)察有無(wú)游離芽胞（淺紅色）和染成深紅色的菱形蛋白結晶體。如發(fā)現游離芽胞形成的不豐富，應再將培養物置室溫2 d～3 d后進(jìn)行檢查。除蘇云金芽胞桿菌外，其他芽胞桿菌不產(chǎn)生蛋白結晶體。
4.3.3生化分型(選做項目)
根據對檸檬酸鹽利用、硝酸鹽還原、淀粉水解、V-P試驗反應、明膠液化試驗，將蠟樣芽胞桿菌分成不同生化型別，見(jiàn)表2。
4.4結果計算
4.4.1 典型菌落計數和確認
4.4.1.1選擇有典型蠟樣芽胞桿菌菌落的平板，且同一稀釋度3個(gè)平板所有菌落數合計在20 CFU～200CFU之間的平板，計數典型菌落數。如果出現a）~f）現象按4.4.2.1中公式（1）計算，如果出現g）現象則按4.4.2.2中公式（2）計算；
a）只有一個(gè)稀釋度的平板菌落數在20 CFU～200 CFU之間且有典型菌落，計數該稀釋度平板上的典型菌落；
b）2 個(gè)連續稀釋度的平板菌落數均在20 CFU～200 CFU之間，但只有一個(gè)稀釋度的平板有典型菌落，應計數該稀釋度平板上的典型菌落；
c）所有稀釋度的平板菌落數均小于20 CFU且有典型菌落，應計數最低稀釋度平板上的典型菌落；
d）某一稀釋度的平板菌落數大于200 CFU且有典型菌落，但下一稀釋度平板上沒(méi)有典型菌落，應計數該稀釋度平板上的典型菌落；
e）所有稀釋度的平板菌落數均大于200 CFU且有典型菌落，應計數最高稀釋度平板上的典型菌落；
f）所有稀釋度的平板菌落數均不在20 CFU～200 CFU之間且有典型菌落，其中一部分小于20 CFU或大于200CFU時(shí)，應計數最接近20 CFU或200 CFU的稀釋度平板上的典型菌落。
g) 2 個(gè)連續稀釋度的平板菌落數均在20 CFU～200 CFU之間且均有典型菌落。
4.4.1.2從毎個(gè)平板中至少挑取5個(gè)典型菌落（小于5個(gè)全選），劃線(xiàn)接種于營(yíng)養瓊脂平板做純培養，30 ℃±1 ℃培養24 h±2 h。
式中：
T——樣品中蠟樣芽胞桿菌菌落數；
A——某一稀釋度蠟樣芽胞桿菌典型菌落的總數；
B——鑒定結果為蠟樣芽胞桿菌的菌落數；
C——用于蠟樣芽胞桿菌鑒定的菌落數；
d ——稀釋因子。
式中：
T——樣品中蠟樣芽胞桿菌菌落數；
A1——第一稀釋度（低稀釋倍數）蠟樣芽胞桿菌典型菌落的總數；
A2——第二稀釋度（高稀釋倍數）蠟樣芽胞桿菌典型菌落的總數；
B1——第一稀釋度（低稀釋倍數）鑒定結果為蠟樣芽胞桿菌的菌落數；
B2——第二稀釋度（高稀釋倍數）鑒定結果為蠟樣芽胞桿菌的菌落數；
C1——第一稀釋度（低稀釋倍數）用于蠟樣芽胞桿菌鑒定的菌落數；
C2——第二稀釋度（高稀釋倍數）用于蠟樣芽胞桿菌鑒定的菌落數；
1.1——計算系數（如果第二稀釋度蠟樣芽胞桿菌鑒定結果為0，計算系數采用1）；
d ——稀釋因子（第一稀釋度）。
4.5 結果與報告
4.5.1根據MYP平板上蠟樣芽胞桿菌的典型菌落數，按4.4中公式（1）、公式（2）計算，報告每g（mL）樣品中蠟樣芽胞桿菌菌數，以CFU/g（mL）表示；如T值為0，則以小于1乘以最低稀釋倍數報告。
4.5.2 必要時(shí)報告蠟樣芽胞桿菌生化分型結果。
