β型溶血鏈球菌檢測培養基（GB4789.11-2014）

A.1改良胰蛋白胨大豆肉湯培養基（Modified tryptone soybean broth,mTSB）

A.1.1基礎培養基（胰蛋白胨大豆肉湯TSB）

A.1.1.1成分

A.1.1.2制法

將A.1.1.1中各成分溶于蒸餾水中，加熱溶解，校正pH至7.3±0.2，121 ℃滅菌15 min，備用。

A.1.2 抗生素溶液

A.1.2.1 多黏菌素溶液

稱(chēng)取10 mg多黏菌素B于10 mL滅菌蒸餾水中，振搖混勻, 充分溶解后過(guò)濾除菌。

A.1.2.2 萘啶酮酸鈉溶液

稱(chēng)取10 mg萘啶酮酸于10 mL 0.05 mol/L氫氧化鈉溶液中，振搖混勻,充分溶解后過(guò)濾除菌。

A.1.3 完全培養基

A.1.3.1 成分

A.1.3.2 制法

無(wú)菌條件下，將A.1.3.1中各成分進(jìn)行混合，充分混勻，分裝備用。

A.2 哥倫比亞CNA血瓊脂(Columbia CNA blood agar)

A.2.1 成分

A.3.1.2 制法

將基礎培養基成分溶解于蒸餾水中，加熱促其溶解。121 ℃高壓滅菌15 min。

A.3.2 無(wú)菌脫纖維綿羊血

無(wú)菌操作條件下，將綿羊血加入到盛有滅菌玻璃珠的容器中，振搖約10min，靜置后除去附有血纖維的玻璃珠即可。

A.3.3完全培養基

A.3.3.1 組分

A.3.3.2 制法

當基礎培養基的溫度為45℃左右時(shí)，無(wú)菌加入綿羊血，混勻。校正pH至7.2±0.2。傾注15 mL于無(wú)菌平皿中，靜置至培養基凝固。使用前需預先干燥平板。預先制備的平板未干燥時(shí)在室溫放置不得超過(guò)4 h，或在4℃冷藏不得超過(guò)7 d。

A.4  革蘭氏染色液

A.4.1  結晶紫染色液基礎培養基

A.4.1.1  成分

A.4.1.2 制法

將結晶紫完全溶解于乙醇中，然后與草酸銨溶液混合。

A.4.2革蘭氏碘液

A.4.2.1成分

A.4.2.2 制法

將碘與碘化鉀先進(jìn)行混合，加入蒸餾水少許充分振搖，待完全溶解后，再加蒸餾水至300mL。

A.4.3.1 成分

A.4.3.2 制法

將沙黃溶解于乙醇中，然后用蒸餾水稀釋。

A.4.4染色操作步驟

將涂片在酒精燈火焰上固定，滴加結晶紫染色液，染1min，水洗；滴加革蘭氏碘液，作用1min，水洗；滴加95％乙醇脫色，約15 s～30s，直至染色液被洗掉，不要過(guò)分脫色，水洗；滴加復染液，復染1min，水洗后進(jìn)行干燥，鏡檢。

A.5胰蛋白胨大豆肉湯（Tryptone soybean broth, TSB）

A.5.1 成分

A.5.2制法

將A.5.1中各成分溶于蒸餾水中，加熱溶解，校正pH至7.3±0.2，121 ℃滅菌15 min，分裝備用。

A.6草酸鉀血漿

A.6.1 成分

A.6.2 制法

草酸鉀0.01 g放入滅菌小試管中，再加入5 mL人血，混勻，經(jīng)離心沉淀，吸取上清液即為草酸鉀血漿。

A.7 0.25％氯化鈣(CaCl2)溶液

A.7.1 成分

A.7.2 制法

稱(chēng)取22.2g氯化鈣（無(wú)水）溶于蒸餾水中，分裝備用。

A.8 3％過(guò)氧化氫(H2O2)溶液

A.8.1 成分

A.8.2 制法

吸取100mL 30％過(guò)氧化氫(H2O2)溶液，溶于蒸餾水中，混勻，分裝備用。

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