FDA標準單增李斯特確證試驗

檢測TSAye平板上的典型菌落形態(tài)，用斜射光觀(guān)察是非常有幫助，但不是必須的。

從30℃或低于30℃培養的平板上挑取生長(cháng)良好的典型菌落，涂于潔凈載玻片上，用0.85%生理鹽水制成懸浮液，壓上蓋玻片于相差顯微鏡的油鏡下觀(guān)察。李斯特氏菌為短桿狀，有輕微的旋轉和翻滾運動(dòng)。而大的桿狀，或快速運動(dòng)的桿狀細菌則不是李斯特氏菌。應用陽(yáng)性的李斯特氏菌做對照。

過(guò)氧化氫酶試驗：李斯特氏菌陽(yáng)性反應。

革蘭氏染色試驗：將培養16-24小時(shí)的培養物進(jìn)行染色。李斯特氏菌呈短桿狀陽(yáng)性菌。但若培養時(shí)間過(guò)長(cháng)，染色會(huì )發(fā)生變化。細胞呈現Coccoidal菌現象。著(zhù)色輕的部位呈現柵欄狀，被當作類(lèi)白喉菌排除掉。

挑取典型菌落接種到TSBye培養基(進(jìn)行糖發(fā)酵試驗)和其它檢測培養基上，35℃培養24小時(shí)，這些培養物可置于4℃冰箱中保存數天，以重復利用。商業(yè)化的試劑盒也可于分離鑒定(見(jiàn)E-11)。

溶血試驗：將7%羊血瓊脂平板底面劃分為20-25個(gè)小格，從TSAye上挑取菌落刺種到血平板上，每格刺種一個(gè)菌落，并刺種陽(yáng)性對照菌(單增李斯特氏菌和綿羊李斯特氏菌)和陰性對照菌(英諾克李斯特氏菌)，于35℃培養24-48小時(shí)，穿刺時(shí)盡量接近底部，但不要觸到底面，同時(shí)避免瓊脂破裂。

于明亮處觀(guān)察潔凈的血瓊脂平板，單增李斯特氏菌和西爾李斯特氏菌在刺種點(diǎn)周?chē)�產(chǎn)生狹小的透明溶血環(huán)，英諾克李斯特氏菌無(wú)溶血環(huán)，綿羊李斯特氏菌產(chǎn)生大的透明溶血環(huán)。注意：不要據此來(lái)區別李斯特氏各種菌，僅僅是一種溶血現象。用CAMP試驗來(lái)確證李斯特氏各種菌。(注意：當血平板的厚度比通常的5mm更薄時(shí)，非常容易觀(guān)察到溶血環(huán)，另外這可以通過(guò)覆蓋一層血瓊脂1-2mm來(lái)實(shí)現)。

硝酸鹽還原試驗：這個(gè)試驗是非必需的。只有默氏李斯特氏菌能降解硝酸鹽，從而區別開(kāi)格氏李斯特氏菌和默氏李斯特氏菌。用TSBye肉湯培養物接種到硝酸鹽肉湯中，35℃培養5天，加入0.2ml試劑A，再加入0.2ml試劑B，混勻，如出現紫紅色，則表明降解了硝酸鹽，存在亞硝酸鹽。如無(wú)顏色變化，則加入少量鋅粉，放置1小時(shí)，如出現紅色，表明仍有硝酸鹽存在，未被細菌降解。也可按以下過(guò)程進(jìn)行檢測:加入0.2ml試劑A，再加入0.2ml試劑C，混勻，如出現桔紅色，則表明降解了硝酸鹽，存在亞硝酸鹽。如無(wú)顏色變化，則加入少量鋅粉，放置1小時(shí)，如出現桔紅色，表明仍有硝酸鹽存在，未被細菌降解。

動(dòng)力試驗：由TSBye肉湯培養物接種到SIM培養基或MTM培養基， 室溫培養7天，逐日觀(guān)察，李斯特氏菌有動(dòng)力，呈傘狀生長(cháng)。MTM培養基上形狀尤為突出，可以明顯觀(guān)察到傘形。另外，通過(guò)相差顯微鏡，可以觀(guān)察30℃ TSBye培養基上的培養物的翻滾運動(dòng)。

將TSBye上培養物接種于含以下0.5%糖的紫色肉湯中(可加入小倒管)：葡萄糖、七葉苷、麥芽糖、甘露醇、鼠李糖和木糖。35℃培養7天。陽(yáng)性反應是產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。不同菌種的生化反應見(jiàn)表1。所有李斯特氏菌對葡萄糖、七葉苷、麥芽糖都是陽(yáng)性反應。除格氏李斯特氏菌和默氏李斯特氏菌外的李斯特氏菌對甘露醇呈陰性反應。若OXA、PALCAM、MOX或LPM(加七葉苷和三價(jià)鐵)的純化物著(zhù)色是確定的，則七葉苷發(fā)酵實(shí)驗可省略

CAMP試驗：當溶血試驗結果不確定時(shí)，可用CAMP實(shí)驗來(lái)區別李斯特氏菌的各個(gè)種。在羊血瓊脂平板上劃兩條平行線(xiàn)，兩條線(xiàn)上分別接種β型溶血金黃色葡萄球菌與馬紅球菌培養物。在該兩線(xiàn)之間，垂直劃線(xiàn)，接種待測培養物，與兩線(xiàn)相近但不相交，于35℃培養24-48小時(shí)后，觀(guān)察溶血情況。單增李斯特氏菌與西爾李斯特氏菌在靠近金黃色葡萄球菌接種點(diǎn)附近的溶血增強，其它李斯特氏菌不溶血。單增李斯特氏菌在24小時(shí)溶血現象比在48小時(shí)更明顯。為使馬紅球菌能長(cháng)出一條很好的劃線(xiàn)，需要將斜面培養物培養48小時(shí)，而不是24小時(shí)。同時(shí)，羊血瓊脂平板需新鮮配制。

上一篇：FDA標準單增李斯特選擇性分離培養

下一篇：ISO檢測方法單增李斯特菌