抑菌效力檢查法-2015中國藥典

       抑菌劑是指抑制微生物生長(cháng)的化學(xué)物質(zhì)，有時(shí)也稱(chēng)防腐劑。抑菌效力檢查法 系用于測定滅菌及非滅菌制劑的抑菌活性，以評價(jià)最終產(chǎn)品的抑菌效力，同時(shí)也 可用于指導生產(chǎn)企業(yè)在研發(fā)階段制劑中抑菌劑濃度的確定。

      如果藥物本身不具有充分的抗菌效力，那么應根據制劑特性（如水溶性制劑）添加適宜的抑菌劑，以防止制劑在正常貯藏或使用過(guò)程中可能發(fā)生的微生物污染和繁殖使藥物變質(zhì)而對使用者造成危害，尤其是多劑量包裝的制劑。

     在藥品生產(chǎn)過(guò)程中，抑菌劑不能用于替代藥品生產(chǎn)的GMP 管理，不能作為 非無(wú)菌制劑降低微生物污染的唯一途徑，也不能作為控制多劑量包裝制劑滅菌前的生物負載的手段。所有抑菌劑都具有一定的毒性，制劑中抑菌劑的量應為最低有效量。同時(shí)，為保證用藥安全，成品制劑中的抑菌劑有效濃度應低于對人體有害的濃度。抑菌劑的抗菌效力在貯存過(guò)程中有可能因藥物的成分或包裝容器等因素影 響而變化，因此，應驗證成品制劑中的抑菌劑效力在效期內不因貯藏條件而降低.

本試驗方法和抑菌劑抑菌效力判斷標準用于包裝未啟開(kāi)的成品制劑

培養基

胰酪大豆胨液體培養基、胰酪大豆胨瓊脂培養基、沙氏葡萄糖液體培養基、沙氏葡萄糖瓊脂培養基?? 照無(wú)菌檢查法（通則 1101）制備。

培養基的適用性檢查

抑菌效力測定用培養基應進(jìn)行培養基的適用性檢查，包括成品培養基、由脫水培養基或按處方配制的培養基均應檢查。

菌種 試驗所用的菌株傳代次數不得超過(guò) 5 代（從菌種保藏中心獲得的冷凍干燥菌種為第0 代），并采用適宜的菌種保藏技術(shù)進(jìn)行保存，以保證試驗菌株的生物學(xué)特性。培養基適用性檢查的菌種及新鮮菌體培養見(jiàn)表1。

表 1 培養基適用性檢查、方法適用性試驗、抑菌效力測定用的試驗菌培養條件

試驗菌株	試驗培養基	培養溫度	培養時(shí)間
金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)〔CMCC(B)26 003〕	胰酪大豆胨瓊脂 培養基或胰酪大 豆胨液體培養基	30～35℃	18～24小時(shí)
銅綠假單胞菌 (Pseudomonas aeruginosa） CMCC(B)10 104〕	胰酪大豆胨瓊脂 培養基或胰酪大 豆胨液體培養基	30～35℃	18～24小時(shí)
大腸埃希菌 (Escherichia coli) CMCC(B)44 102〕	胰酪大豆胨瓊脂 培養基或胰酪大 豆胨液體培養基	30～35℃	18～24小時(shí)
白色念珠菌 (Candida albicans) 〔CMCC(F) 98 001〕	沙氏葡萄糖瓊脂 培養基或沙氏葡 萄糖液體培養基	20～25℃	24-48小時(shí)
黑曲霉 (Aspergillus niger) 〔CMCC(F) 98 003〕	沙氏葡萄糖瓊脂 培養基或沙氏葡 萄糖液體培養基	20～25℃	5～7天或直到 獲得豐富的孢 子

菌液制備 取表 1 大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌的新鮮培養物用pH7.0 無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成適宜濃度的菌懸液。取表2 黑曲霉的新鮮培養物加入3～5ml 含0.05％（ml/ml）聚山梨酯80 的pH7.0 無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后，采用適宜方法吸出孢子懸液至無(wú)菌試管內，用含0.05％ml/ml）聚山梨酯80 的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成適宜濃度的孢子懸液。 菌液制備后若在室溫下放置，應在2 小時(shí)內使用；若保存在2～8℃，可在24 小時(shí)內使用。黑曲霉孢子懸液可保存在2～8℃，在驗證過(guò)的貯存期內使用。

適用性檢查 分別接種不大于 100cfu 的大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌的菌液至胰酪胨大豆瓊脂培養基，每株試驗菌平行制備2 個(gè)平皿，混勻，凝固，置30～35℃培養不超過(guò)3 天，計數；分別接種不大于100cfu 的白色念珠菌、黑曲霉的菌液至沙氏葡萄糖瓊脂培養基，每株試驗菌平行制備2 個(gè)平皿，混勻，凝固，置20～25℃培養不超過(guò)5 天，計數；同時(shí)，用對應的對照培養基替代被檢培養基進(jìn)行上述試驗。

結果判定 若被檢培養基上的菌落平均數不小于對照培養基上菌落平均數的70%，且菌落形態(tài)大小與對照培養基上的菌落一致，判該培養基的適用性檢查符合規定。

菌種 抑菌效力測定用菌種見(jiàn)表 1，若需要，制劑中常見(jiàn)的污染微生物也可作為試驗菌株。

菌液制備 新鮮菌體培養見(jiàn)表 1，銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、大腸 埃希菌、白色念珠菌若為瓊脂培養物，加入適量的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液將瓊脂 表面的培養物洗脫，并將菌懸液移至無(wú)菌試管內， 然后用 0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液沖洗并制成每1ml 含菌數約為10⁸cfu 的菌懸液；若為液體培養物，離心收集菌體，用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液沖洗并制成每1ml 含菌數約為10⁸cfu 的菌懸液。取黑曲霉的新鮮培養物加入3～5ml 含0.05％（ml/ml）聚山梨酯80 的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫，然后，用適宜方法吸出孢子懸液至無(wú)菌試管內，加入適量的含0.05％（ml/ml）聚山梨酯80 的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成每1ml 含孢子數10⁸cfu 的孢子懸液。測定1ml 菌懸液中所含的菌數。

菌液制備后若在室溫下放置，應在 2 小時(shí)內使用；若保存在2～8℃，可在24 小時(shí)內使用。黑曲霉的孢子懸液可保存在2～8℃，在1 周內使用。

供試品接種 抑菌效力可能受試驗用容器特征的影響，如容器的材質(zhì)、形狀、體積及封口的方式等。因此，只要供試品每個(gè)包裝容器的裝量足夠試驗用，同時(shí)容器便于按無(wú)菌操作技術(shù)接入試驗菌液、混合及取樣等，一般應將試驗菌直接接種于供試品原包裝容器中進(jìn)行貯存。若因供試品的性狀或每個(gè)容器裝量等因素需將供試品轉移至無(wú)菌容器時(shí)，該容器的材質(zhì)不得影響供試品的特性（如吸附作用），特別應注意不得影響供試品的pH，pH 對抑菌劑的活性影響很大，同時(shí)容器的口徑大小應便于供試品的轉移及混勻。取包裝完整的供試品至少 5 份，直接接種試驗菌，或取適量供試品分別轉移至5 個(gè)適宜的無(wú)菌容器中（若試驗菌株數超過(guò)5 株，應增加相應的供試品份數），每一容器接種一種試驗菌， 1g 或1ml 供試品中接菌量為105～106cfu，接種菌液的體積不得超過(guò)供試品體積的1%,充分混合，使供試品中的試驗菌均勻分布，然后置20～25℃避光貯存。

存活菌數測定 根據產(chǎn)品類(lèi)型，按表2-1、表2-2、表2-3 規定的間隔時(shí)間，分別從上述每個(gè)容器中取供試品1ml(g)，測定每份供試品中所含的菌數，測定細菌用胰酪胨大豆瓊脂培養基，測定真菌用沙氏葡萄糖瓊脂培養基。存活菌數測定方法及方法適用性試驗照非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計數法（通則1105）進(jìn)行，方法適用性試驗用菌株見(jiàn)表1，菌液制備同培養基適用性檢查，方法適用性試驗試驗菌的回收率不得低于70%。根據存活菌數測定結果，計算1ml(g)供試品各試驗菌所加的菌數及各間隔時(shí)間的菌數，并換算成lg 值，試驗結果按有效數字的修約規則進(jìn)舍，保留小數點(diǎn)后1 位有效數字。結果判斷 供試品抑菌效力評價(jià)標準見(jiàn)表 2-1、表2-2、表2-3，表中的“減少的lg 值”是指各間隔時(shí)間測定的菌數lg 值與1ml(g)供試品中接種的菌數lg 值的相差值。表中”A”是指應達到的抑菌效力標準，特殊情況下，如抑菌劑可能增加不良反應的風(fēng)險，那至少應達“B”的抑菌效力標準。

 

NR：試驗菌未恢復生長(cháng)。
NI：未增加，是指對前一個(gè)測定時(shí)間，試驗菌增加的數量不超過(guò)0.5 lg。

表2 -2 局部給藥制劑抑菌效力判斷標準

			減少的lg值
			2d	7d	14d	28d
	細菌		2	3	-	NR
			-	-	3	NI
	真菌		-	-	2	NI
			-	-	1	NI

 

NI：未增加，是指對前一個(gè)測定時(shí)間，試驗菌增加的數量不超過(guò)0.5 lg。

表2 -3 口服制劑抑菌效力判斷標準

	減少的lg值
	14d	28d
細菌	3	NI
真菌	1	NI

NI：未增加，是指對前一個(gè)測定時(shí)間，試驗菌增加的數量不超過(guò)0.5 lg。

說(shuō)明：

1. 抑菌劑效力檢查法指導原則收載于《中國藥典》一、二、三部附錄中， 內容一致。

2.本稿是依據2010 年版“抑菌劑效力檢查法指導原則”修訂而成，參照歐洲藥典對抑菌效力檢查結果判斷標準進(jìn)行了修訂。

 

 

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