乳酸菌飲料中乳酸菌的微生物學(xué)檢驗

   
   【GB/T 16347—1996】 
乳酸菌飲料中乳酸菌的微生物學(xué)檢驗 
　　1　主題內容與適用范圍
　　本標準規定了乳酸菌飲料中乳酸菌檢驗的技術(shù)要求。
　　本標準適用于以鮮乳、乳粉或輔以大豆等為原料，經(jīng)乳酸菌發(fā)酵加工制成的具有相應風(fēng)味的活性乳酸菌飲料。
　　2　引用標準
　　GB 4789.28　食品衛生微生物學(xué)檢驗　染色法、培養基和試劑
　　3　術(shù)語(yǔ)
　　乳酸菌：一群能分解葡萄糖或乳糖產(chǎn)生乳酸，需氧和兼性厭氧，多數無(wú)動(dòng)力，過(guò)氧化氫酶陰性，革蘭氏陽(yáng)性的無(wú)芽胞桿菌和球菌。
　　乳酸菌菌落總數：檢樣在一定條件下培養后，所得1mL檢樣中所含乳酸菌菌落的總數。
　　4　設備和材料
　　4.1　溫箱：36±1℃。
　　4.2　冰箱：0～4℃。
　　4.3　恒溫水�。�46±1℃。
　　4.4　電爐：可調式。
　　4.5　吸管：容量為1，10和25mL。
　　4.6　廣口瓶或三角瓶：容量為500mL。
　　4.7　平皿：直徑為9cm。
　　4.8　試管：18×180mm。
　　4.9　顯微鏡。
　　5　培養基和試劑
　　5.1　改良TJA培養基(改良番茄汁瓊脂培養基)。
　　5.2　改良MC培養基(Modified Chalmers培養基)。
　　5.3　0.1%美蘭牛乳培養基。
　　5.4　6.5%氯化鈉肉湯。
　　5.5　pH9.6葡萄糖肉湯。
　　5.6　40%膽汁肉湯。
　　5.7　淀粉水解培養基。
　　5.8　精氨酸水解培養基。
　　5.9　乳酸桿菌糖發(fā)酵管。
　　5.10　七葉苷培養基。
　　5.11　革蘭氏染色液：按GB 4789.28規定執行。
　　5.12　3%過(guò)氧化氫溶液：按GB 4789.28規定執行。
　　5.13　蛋白胨水、靛基質(zhì)試劑：按GB 4789.28規定執行。
　　5.14　明膠培養基：按GB 4789.28規定執行。
　　5.15　硝酸鹽培養基、硝酸鹽試劑：按GB 4789.28規定執行。
　　5.16　生理鹽水：定量分裝于三角瓶和試劑管內滅菌。
　　6　乳酸菌菌落總數的測定　　
　　6.1　檢驗程序
　　乳酸菌菌落總數檢驗程序如下：
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　　6.2　操作步驟
　　6.2.1　以無(wú)菌操作將經(jīng)過(guò)充分搖勻的檢樣25mL(或25g)放入含有225mL滅菌生理鹽水的滅菌廣口瓶?jì)茸鞒?∶10的均勻稀釋液。
　　6.2.2　用1mL滅菌吸管吸取1∶10稀釋液1mL，沿管壁徐徐注入含有9mL滅菌生理鹽水的試管內(注意吸管尖端不要觸及管內稀釋液)。
　　6.2.3　另取1mL滅菌吸管，按上述操作順序，作10倍遞增稀釋液，如此每遞增一次，即換用1支1mL滅菌吸管。
　　6.2.4　選擇2～3個(gè)以上適宜稀釋度，分別在作10倍遞增稀釋的同時(shí)，即以吸取該稀釋度的吸管移1mL稀釋液于滅菌平皿內，每個(gè)稀釋度作兩個(gè)平皿。
　　6.2.5　稀釋液移入平皿后，應及時(shí)將冷至50℃的乳酸菌計數培養基(改良TJA或改良MC)注入平皿約15mL，并轉動(dòng)平皿使混合均勻。同時(shí)將乳酸菌計數培養基傾入加有1mL稀釋液檢樣用的滅菌生理鹽水的滅菌平皿內作空白對照，以上整個(gè)操作自培養物加入培養皿開(kāi)始至接種結束須在20min內完成。
　　6.2.6　待瓊脂凝固后，翻轉平板，置36±1℃溫箱內培養72±3h取出，觀(guān)察乳酸菌菌落特征(見(jiàn)表1)，選取菌落數在30～300之間的平板進(jìn)行計數。計算后，隨機挑取5個(gè)菌落數進(jìn)行革蘭氏染色，顯微鏡檢查并做過(guò)氧化氫酶試驗。革蘭氏陽(yáng)性，過(guò)氧化氫酶陰性，無(wú)芽胞的球菌或桿菌可定為乳酸菌。根據證實(shí)為乳酸菌菌落計算出該皿內的乳酸菌數，然后乘其稀釋倍數即得每毫升樣品中乳酸菌數。例如，檢樣10－4的稀釋液在改良TJA瓊脂平板上，生成的可疑菌落為35個(gè)，取5個(gè)鑒定，證實(shí)為乳酸菌的是4個(gè)，則1mL檢樣中乳酸菌數為：
　　 
　　6.3　乳酸菌在改良TJA和改良MC培養基上菌落生長(cháng)形態(tài)特征見(jiàn)表1。
　　表1　乳酸菌在不同培養基上菌落特征
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　　7　乳酸菌的鑒定
　　對上述分離到的乳酸菌需進(jìn)行菌種鑒定時(shí)，則作以下試驗。
　　7.1　菌種制備：自平板上挑取菌落，接種于改良TJA或改良MC瓊脂斜面，于36±1℃，24～48h培養，刮取菌苔，分別進(jìn)行下列試驗。
　　7.2　乳酸桿菌鑒定試驗：極少見(jiàn)還原硝酸鹽，不液化明膠，不產(chǎn)生靛基質(zhì)和硫化氫。
　　7.3　常見(jiàn)乳桿菌屬內種的碳水化合物反應，見(jiàn)表2。
　　7.4　產(chǎn)乳酸的鏈球菌的鑒別試驗，見(jiàn)表3。
　　表2　常見(jiàn)乳桿菌屬內種的碳水化合物反應
　�。ū砺裕�
　　表3　 乳酸的鏈球菌的鑒別表
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