出口畜產(chǎn)品中炭疽桿菌檢驗方法

   
   中華人民共和國進(jìn)出口商品檢驗行業(yè)標準 SN 0331—94
            出口畜產(chǎn)品中炭疽桿菌檢驗方法
Methods for the inspection of bacillus anthrax
in animal by-products for export 代替 ZB X09 010—86
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1 主題內容與適用范圍
本標準規定了出口畜產(chǎn)品中炭疽桿菌的檢驗。
本標準適用于出口鬃、毛、絨、野生動(dòng)物毛皮、生骨粒及其他畜產(chǎn)品中炭疽桿菌
的檢驗。
2 設備和材料
2.1 離心機：帶容量在 500mL以上的離心管。
2.2 恒溫培養箱：36±1℃。
2.3 恒溫水�。�30～65℃。
2.4 生物學(xué)顯微鏡。
2.5 三角燒瓶：容量 250mL、500mL和 1 000mL,帶膠塞。
2.6 平皿：直徑 90mm或 100mm。
2.7 試管：10mm×120mm 和 20mm×140mm 。
2.8 吸管：1 ml和10 ml,帶 0.01 mL 和0.1 mL刻度。
2.9 L形玻璃棒。
2.10 注射器：1 mL 帶 5號針頭。
2.11 棉拭子：長(cháng)180 mm 的竹簽或鐵絲,一端裹 20～30 mm長(cháng)的棉球,用水浸濕,另一端
裹在試管的棉塞內,插入試管高壓滅菌。
2.12 棉布袋：70 mm×130 mm,帶縮口繩。
2.13 養鼠罐。 
3 培養基和試劑
3.1 溶菌酶多粘菌素瓊脂：見(jiàn)A1。
3.2 戊烷脒多粘菌素瓊脂：見(jiàn)A2。
3.3 營(yíng)養肉湯：見(jiàn)A3。
3.4 營(yíng)養瓊酯：見(jiàn)A4。
3.5 洗樣液：見(jiàn)A5。
3.6 生理鹽水：見(jiàn)A6。
3.7 緩沖生理鹽水：見(jiàn)A7。
3.8 固定液：見(jiàn)A8。
3.9 炭疽桿菌噬菌體：見(jiàn)A9。
3.10 革蘭氏染色液：見(jiàn)A10。
3.11 大豆凝集素稀釋液：見(jiàn)A11。
4 抽樣 
4.1 鬃、毛、絨、生骨粒
4.1.1 抽樣數量
按生產(chǎn)日期或原料來(lái)源劃分批次。每批按 30％開(kāi)包(箱)抽樣或在扎包(裝箱)時(shí)由
每包(箱)各取一份樣品。
4.1.2 抽樣方法
用火焰滅菌的鑷子或戴經(jīng)消毒的乳膠手套從每包(箱)的不同部位共抽樣 3～5g,裝入
滅菌棉布袋內,將袋口扎緊,作上批次標記。
4.1.3 送樣
將樣品裝入塑料袋或鐵桶內,密封后送樣。 
4.2 動(dòng)物毛皮
4.2.1 抽樣比例
逐張取樣。
4.2.2 抽樣方法
用滅菌棉拭子涂擦樣皮的真皮面。將棉拭子插入試管,塞緊棉塞。
4.2.3 送樣
將試管逐支用紙包裹,裝入鐵桶內,再用棉花或軟紙填充空隙,密封后送樣。
5 樣品處理
5.1 鬃、毛、絨、生骨粒
5.1.1 根據樣品多少將適當數量的同批樣品(最多不超過(guò) 10份)合編為一個(gè)檢驗樣品單
位,作好記錄。
5.1.2 從合編為一個(gè)檢驗樣品單位的每個(gè)樣品袋中各取 1～2g樣品,一起放入一個(gè)適當
大小的滅菌三角燒瓶中。
5.1.3 加樣品量 30～40倍(W/V)的預冷洗樣液于三角燒瓶,用滅菌膠塞將瓶口塞嚴。
5.1.4 將三角燒瓶放入冰水浴或 0～4℃冰箱內,間或搖動(dòng)約 1h。
5.1.5 將瓶中洗樣液倒入 500mL滅菌離心管內,蓋住管口,以3000r/min離心20min。
5.1.6 棄去上清液(注意防止污染),加少許滅菌水,使沉淀均勻懸浮。
5.1.7 將離心管靜置 5～10min,待雜質(zhì)下沉后,將上懸液移入另一支滅菌試管內,于
65℃恒溫水浴加熱 30 min。
5.1.8 加洗樣液后的樣品于熱處理前如不能及時(shí)檢驗,應貯于0～4℃冰箱內,以防芽
胞發(fā)芽。
5.2 動(dòng)物毛皮
如不立即檢驗,將棉拭子放于0～4℃冰箱內。
6 檢驗方法
6.1 分離培養
6.1.1 鬃、毛、絨、生骨粒
6.1.1.1 根據每管所包括樣品份數之多少,各接種 1～3個(gè)溶菌酶多粘菌素平板或戊烷
脒多粘菌素平板。接種時(shí),用滅菌吸管吸取樣液,滴加于平板表面,各0.1～0.3mL。如有
剩余樣品,可增接數個(gè)平板,直至將樣品接種完。
6.1.1.2 用滅菌 L形玻璃棒將滴加的樣液涂布均勻。如樣液較多,可將平板置于36±1℃
溫箱,微開(kāi)皿蓋,使樣液迅速干燥。
6.1.1.3 翻轉平皿,置于36±1℃恒溫箱,培養 24～48h。
6.1.2 動(dòng)物毛皮
6.1.2.1 將棉拭子由試管內取出,各涂抹一個(gè)溶菌酶多粘菌素平板或戊烷脒多粘菌平板。
6.1.2.2 翻轉平皿,置于36± 1℃恒溫箱,培養 24～48 h。
6.2 菌落及菌形觀(guān)察
6.2.1 將培養的平板取出,用肉眼,必要時(shí)借助放大鏡觀(guān)察有無(wú)典型炭疽桿菌菌落。炭疽
桿菌菌落扁平、暗灰色、不透明、無(wú)光澤、表面粗糙、邊緣不整齊。用放大鏡觀(guān)察,邊緣
呈卷發(fā)狀,用接種針探觸,有粘滯感,挑之,可拉起絲。
6.2.2 從典型或可疑菌落取培養物制備涂膜,經(jīng)革蘭氏染色,鏡檢。炭疽桿菌被染成藍
紫色,由多個(gè)菌縱連成長(cháng)鏈。少數單個(gè)菌呈大桿狀,兩端平齊。有的菌體中央可見(jiàn)卵圓形
不著(zhù)色的芽胞。芽胞不使菌體膨大。
6.3 肉湯培養特性觀(guān)察
取菌落和菌形均似炭疽桿菌的培養物,接種肉湯管,于 36±1℃恒溫箱培養 5～12h,
觀(guān)察細菌生長(cháng)情況。炭疽桿菌在肉湯中生長(cháng)初期的特征是：肉湯上部澄清,無(wú)菌膜,下部
有絮狀沉淀,沉淀不易搖散。
6.4 確定試驗
6.4.1 大豆凝集素吸收試驗
6.4.1.1 方法
a. 加大豆凝集素稀釋液(A11)一滴于比色板或載玻片上。
b. 用接種環(huán)取一滿(mǎn)環(huán)可疑菌落,研混于大豆凝集素稀釋液內成濃厚菌液,持續攪拌
2～3min。
c. 加一滴 5％兔血球懸液,攪勻,前后傾動(dòng)玻片 3～5min,觀(guān)察血球是否凝集。
6.4.1.2 判定
＋＋＋＋：血球凝集成塊狀,均勻散布,液體無(wú)色。
＋＋＋：血球凝集成大顆粒,均勻散布,液體無(wú)色。
＋＋：血球凝集成顆粒,均勻散布,液體無(wú)色。
＋：血球凝集成細小顆粒,均勻散布,液體無(wú)色。
±：血球凝集成細微顆粒,均勻散布,液體呈不顯著(zhù)黃紅色。
－：血球不凝集,搖動(dòng)后匯集于中央,呈淡黃紅色,液體呈不顯著(zhù)黃紅色。
注：“＋＋＋”～“＋”為陽(yáng)性�！啊馈睘榭梢��！埃�”為陰性。
6.4.2 噬菌體裂解試驗
6.4.2.1 方法
a. 用營(yíng)養瓊脂平板的皿底外面畫(huà)三個(gè)直徑約 30mm ,相隔約 20mm為圓圈。
b. 用接種環(huán)取可疑炭疽桿菌的新鮮肉湯培養物涂滿(mǎn)與兩個(gè)圓圈相對應的瓊脂表面。
另取已知炭疽桿菌的新鮮肉湯培養物,涂滿(mǎn)與第三個(gè)圓圈相對應的瓊脂表面,作上區分的
標記。
c. 待菌液被吸干后,在接種被檢菌的圓圈內,一個(gè)加一滴無(wú)菌肉湯,另一個(gè)加一
滴炭疽桿菌噬菌體。在接種已知炭疽桿菌的圓圈內,加一滴炭疽桿菌噬菌體。
d. 將平皿放入36±1℃ 恒溫箱(隔架面要平,以防噬菌體液流散),微開(kāi)皿蓋,使
液體迅速干燥。然后翻轉平皿,培養12～18h。
6.4.2.2 判定
a. 加噬菌體的兩個(gè)圓圈內都出現蝕斑,加肉湯的圓圈內無(wú)蝕斑,為陽(yáng)性反應。
b. 加已知炭疽桿菌的圓圈內出現蝕斑,加被檢菌的兩個(gè)圓圈內無(wú)蝕斑,為陰性反應。
c. 三個(gè)圓圈內都無(wú)蝕斑,表明噬菌體已失效,應另?yè)Q有效噬菌體進(jìn)行試驗。
6.4.3 串珠試驗
6.4.3.1 方法
a. 取適量 4～12h可疑炭疽桿菌肉湯培養物,接種于 1.8mL肉湯管內(制備濕片在低
倍顯微鏡下檢查,每個(gè)視野應含菌鏈 5～10條)。
b. 加 5IU/mL青霉素 0.2mL,使青霉素最終濃度為 0.5IU/mL 。
C. 于 37℃水浴培養 1～2h ,取出,加入 20％ 福爾馬林 0.25 mL,固定 10 min。
d. 制備濕片,在顯微鏡下檢查。
6.4.3. 判定
＋＋＋＋：菌體大而圓,均勻,排列整齊；
＋＋＋：菌體圓,均勻,排列整齊；
＋＋：菌體橢圓,排列整齊；
＋：菌體均勻腫大,變粗；
±：菌體大小不一,不圓,排列不整齊；
－：菌體形態(tài)無(wú)變化。
注：“＋＋＋＋”～“＋”為陽(yáng)性�！啊馈睘榭梢��！埃�”為陰性。
6.4.4 動(dòng)物試驗
6.4.4.1 取可疑炭疽桿菌的肉湯培養物,用生理鹽水稀釋為 10 000個(gè)菌/mL(微混濁),
接種 2～3只小白鼠。一只于皮下注射 0.1mL；其余每只于腹腔注射 0.2mL。
6.4.4.2 如小白鼠死亡(通常于1～3d內),立即進(jìn)行剖檢,觀(guān)察有無(wú)炭疽病理變化(如皮
下膠樣水腫,脾臟腫大,血凝不良),制備數張血液和腹水涂片,供做菌形檢查,同時(shí)取
病變材料或體液接種數管肉湯,以備核查。
6.4.5 染色鏡檢
6.4.5.1 染色液的配制
A液：
美藍 0.3g
乙醇(95％) 30.0mL
B液：
0.01％氫氧化鉀溶液 100mL
將 A、B兩液混合而成。
6.4.5.2 染色方法
a. 將被檢材料的涂片浸入固定液內 15～20 min；
b. 滴加染色液浸沒(méi)涂膜,染色 1～2 min；
c. 用水沖去染色液,自然干燥或用吸墨紙吸干水分；
d. 鏡檢。
6.4.5.3 判定
炭疽菌菌體呈藍色,粗大桿狀,兩端平齊,相連成短鏈或成對,菌體周?chē)�以淡藍紫色
莢膜。
7 結果的判定和報告
7.1 結果的判定
在菌落形態(tài)、細菌形態(tài)和肉湯生長(cháng)特性三項中有一項不符合炭疽桿菌特征時(shí),判為
非炭疽桿菌。在其余五項試驗(確定試驗)中有兩項或更多項不符合炭疽桿菌特征時(shí),判
為非炭疽桿菌；全部符合或僅有一項不符合炭疽桿菌特征時(shí),判為有炭疽桿菌。
7.2 結果的報告
7.2.1 凡結果判為非炭疽桿菌的檢驗樣品,報告該樣品所代表的同批產(chǎn)品“經(jīng)檢驗未發(fā)
現炭疽桿菌”。
7.2.2 凡結果判為有炭疽桿菌的檢驗樣品,報告該樣品所代表的同批產(chǎn)品“經(jīng)檢驗發(fā)現
炭疽桿菌”。
附 錄 A
培養基和試劑
(補充件)
A1 溶菌酶多粘菌素瓊脂(Knisely)
營(yíng)養瓊脂(見(jiàn)A4) 1 000mL
多粘菌素 3 000IU
溶菌酶 4 mg/mL 溶液 10 mL
乙酸亞鉈 4 mg/mL 溶液 10 mL
EDTA 20 mg/mL 溶液 10 mL
除營(yíng)養瓊脂外,將其他成分用滅菌蒸餾水配成適當貯備液,按以上量加于冷至 50～
55℃ 的滅菌營(yíng)養瓊脂內,充分搖勻,傾注平板。
A2 戊烷脒多粘菌素瓊脂
A2.1 基礎培養基
牛肉膏 3.0g
蛋白胨 20.0g 
氯化鈉 5.0g
瓊脂 20.0g
蒸餾水 1 000.0mL
將各成分加于蒸餾水中,煮沸至完全溶解,調整pH至7.4,過(guò)濾,分裝于三角燒
瓶中,每瓶 400mL,121℃高壓滅菌 20min。臨時(shí)用加熱融化,放于 45～50℃恒溫水
浴內保溫。
A2.2 戊烷脒稀釋液
稱(chēng)取戊烷脒 0.1g,溶于 4mL滅菌蒸餾水內。貯存在 0～4℃ 冰箱,備用。
A2.3 多粘菌素稀釋液
取多粘菌素 B一瓶,加滅菌蒸餾水使其溶解,再用滅菌蒸餾水將其稀釋為3000IU/mL。
貯存于0～4℃冰箱,備用。
A2.4 脫纖維羊血
以無(wú)菌操作采羊血 50～10 mL ,注入含玻璃小珠的滅菌三角燒瓶中,立即轉搖數分
鐘。貯存于 0～4℃冰箱,備用。
A2.5 完全培養基
基礎培養基(45～50℃) 400.0 mL
戊烷脒稀釋液 0.4 mL
多粘菌素稀釋液 0.4 mL
脫纖維羊血 8.0 mL
以無(wú)菌操作將后三種成分加入基礎培養基內,充分搖勻,傾注于滅菌皿內,每皿15mL
左右。
A3 營(yíng)養肉湯．
牛肉膏 3.0g
蛋白胨 20.0g
氯化鈉 5.0g
蒸餾水 1000.0mL
將各成分溶于蒸溜水中,調整pH至7.4,分裝于試管內,每管1.0mL,121℃高壓滅菌15min。 
A4 營(yíng)養瓊脂
牛肉膏 3.0g
蛋白胨 20.0g
氯化鈉 5.0g
瓊脂 20.0g
蒸餾水 1 000.0mL
將各成分加于蒸餾水中,煮沸至完全溶解,補足失去的水分,調整pH至7.2,過(guò)濾,
121℃ 高壓滅菌 20 min 。待冷至 50℃左右時(shí),傾注于平皿,制成平板。
A5 洗樣液
吐溫-20 2.5mL
蒸餾水 1 000mL
將吐溫-20加于蒸餾水中,充分攪勻,分裝于三角燒瓶或試劑瓶?jì)?121℃高壓滅菌。
貯存于 0～4℃冰箱,備用。
A6 生理鹽水
氯化鈉 8.5g
蒸餾水 1000.00mL
待氯化鈉完全溶解后,分裝于三角燒瓶或試劑瓶?jì)?121℃高壓滅菌 20min。
A7 緩沖生理鹽水
無(wú)水磷酸氫二鈉 1.42 g
氯化鈉 8.50 g
蒸餾水 1 000.00 mL
將各成分加于蒸餾水中,加熱攪拌使完全溶解。如欲長(cháng)期保存,可加 0.1g硫柳汞(最
終濃度為 0.01％)。
A8 固定液
無(wú)水乙醇 600 mL
三氯甲烷 300 mL
甲醛溶液(36％～38％) 100 mL
將三種成分混勻,貯存于磨砂口帶蓋試劑瓶?jì)取?br>A9 炭疽桿菌噬菌體
γ或 ω型的均可使用。
A10 革蘭氏染色液及染色方法
A10.1 Hucker 氏結晶紫液
A液：
結晶紫(或龍膽紫) 2.0g
�� 乙醇(95％) 20.0mL
B液：
草酸銨 0.8g
蒸餾水 80.0 mL
將 A、B兩液混勻,放置 24 h后,用粗濾紙過(guò)濾。貯于磨砂口滴瓶?jì)取?nbsp;
A10.2 革蘭氏碘液
碘 1.0 g
碘化鉀 2.0 g
蒸餾水 300.0 mL 
將碘和碘化鉀放于乳缽內,研成細粉。先后分三次分別加蒸餾水1mL 、5mL和10 mL,
繼續研磨至完全溶解,倒入褐色瓶中。再加水將殘留于乳缽的碘液洗入瓶中,補加蒸餾水
至300mL。
A10.3 脫色劑
95％乙醇 適量
貯于磨砂口滴瓶中。
A10.4 Hucker氏復染液(貯備液)
沙黃 O 2.5 g
乙醇(95％) 100mL
臨用時(shí),取適量貯備液,加蒸餾水稀釋成 1:10稀釋液。
A10.5 染色方法
a. 于載玻片上制備涂膜,自然干燥；
b. 將玻片浸入固定液內,固定 1 min；
c. 加結晶紫于涂膜上,染色 1 min；
d. 用水沖去染色液,淋去多余的水； 
e. 加革蘭氏碘液于涂膜上,媒染 1 min；
f. 用水沖去碘液；
g. 連續加 95％乙醇流過(guò)涂膜,至無(wú)紫色脫掉；
h. 用水沖洗玻片,淋去多余的水；
i. 加復染液于涂膜上,染色 10～30 s；
j. 用水沖去染色液；
k. 用吸墨紙吸干水分或自然干燥；
l. 鏡檢。
A11 大豆凝集素稀釋液
按試劑使用說(shuō)明制備工作稀釋液,貯于 4℃冰箱備用。
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附加說(shuō)明：
本標準由中華人民共和國進(jìn)出口商品檢驗局提出。
本標準由中華人民共和國內蒙古進(jìn)出口商品檢驗局負責起草。
本標準主要起草人甄宏太、周云霞。
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中華人民共和國國家進(jìn)出口商品檢驗局 1994-12-26批準 1995-05-01實(shí)施

 

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