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6.1生產(chǎn)商及實(shí)驗室自制培養基和試劑的質(zhì)量控制的測試方法
6.1.1非選擇性分離和計數固體培養基的目標菌生長(cháng)率定量測試方法
6.1.1.1平板的制備與保存
傾注融化的培養基到平皿中，使之在平皿中形成一個(gè)至少3 mm厚的瓊脂層（直徑90 mm的平皿通 常要加入18 mL〜20 mL瓊脂培養基），需添加試劑的培養基，應使培養基冷卻至47℃~50℃后才添 加試劑。傾注后將平板放到水平平面，使瓊脂冷卻凝固。凝固后的培養基應立即使用或存放于暗處和(或) 2℃~8℃冰箱的密封袋中，在有效期內使用。使用前應對瓊脂表面進(jìn)行干燥，但應注意不要過(guò)度干燥。
6.1.1.2工作菌懸液的制備
將標準儲備菌株接種到非選擇性肉湯培養過(guò)夜或采用其他方法，制備10倍系列稀釋的菌懸液。生 長(cháng)率測試常用每平板的接種水平為20 CFU~200 cfu
6.1.1.3 接種
選擇合適稀釋度的工作菌懸液0.1 mL，均勻涂布接種于待測平板和參比平板。每一稀釋度接種兩 個(gè)平板�？墒褂寐菪桨宸�(見(jiàn)附錄F)或傾注法進(jìn)行接種，并按標準規定的培養條件培養平板。
6.1.1.4 計算
選擇菌落數適中的平板進(jìn)行計數，按下列式（1)計算生長(cháng)率。
PR=NS/NO
式中：
PR—生長(cháng)率；
NS—待測培養基平板上得到的菌落總數；
NO—參比培養基平板上獲得的菌落總數（該菌落總數應2100CFU)
參比培養基的選擇：一般細菌采用TSA，一般霉菌和酵母采用沙氏葡萄糖瓊脂，對營(yíng)養有特殊要 求的微生物采用適合其生長(cháng)的不含抑菌劑或抗生素的培養基。
6.1.1.5結果解釋
目標菌在培養基上應呈現典型的生長(cháng)。非選擇性分離和計數固體培養基上目標菌的生長(cháng)率應不小 于0.7
6.1.2 選擇性分離和計數固體培養基的測試方法
6.1.2.1目標菌生長(cháng)率定量測試方法
6.1.2.1.1平板的制備與保存
按照6.1.1.1中要求進(jìn)行。
6.1.2.1.2工作菌懸液的制備
按照 6.1.1.2中要求進(jìn)行。
6.1.2.1.3 接種
按照6.1.1.3中要求進(jìn)行。
6.1.2.1.4 計算
按照6.1.1.4中要求進(jìn)行。
6.1.2.1.5 結果解釋
目標菌在培養基上應呈現典型的生長(cháng)。選擇性分離固體培養基上目標菌的生長(cháng)率一般不小于0.5， 最低應為0.1；選擇性計數固體培養基上目標菌的生長(cháng)率一般不小于0.7。
6.1.2.2非目標菌(選擇性)半定量測試方法
6.1.2.2.1平板的制備與保存
按照6.1.1.1中要求進(jìn)行。
6.1.2.2.2工作菌懸液的制備
將標準儲備菌株接種到非選擇性肉湯培養過(guò)夜作為工作菌懸液。
6.1.2.2.3 接種
用1 μL接種環(huán)取選擇性測試工作菌懸液1環(huán)，在待測培養基表面劃六條平行直線(xiàn)（如圖1)，同時(shí) 接種兩個(gè)平板，劃線(xiàn)時(shí)可在培養基下面放一個(gè)模板圖，按標準規定的培養條件培養平板。
操作時(shí)用接種環(huán)而不用接種針，接種環(huán)應完全浸入培養基中。取一滿(mǎn)環(huán)接種物，將接種環(huán)接觸容 器邊緣3次可去除多余的液體。劃線(xiàn)時(shí)，接種環(huán)與瓊脂平面的角度應為20°〜30°。接種環(huán)壓在瓊脂表 面的壓力和劃線(xiàn)速度前后一致，整個(gè)劃線(xiàn)應快速連續，移取液體培養物時(shí)應將接種環(huán)伸入培養液下部 分以防止環(huán)上產(chǎn)生氣泡或泡沫。
圖1非目標、菌半定量劃線(xiàn)法接種模式圖
6.1.2.2.4 計算
培養后按以下方法對培養基計算生長(cháng)指數G每條有比較稠密菌落生長(cháng)的劃線(xiàn)則G為1，每個(gè)培養 皿上最多為6分。如果僅一半的線(xiàn)有稠密菌落生長(cháng)，則G為0.5。如果劃線(xiàn)上沒(méi)有菌落生長(cháng)、生長(cháng)量少于 劃線(xiàn)的一半或菌落生長(cháng)微弱，則G為0記錄每個(gè)平板的得分總和便得到G。同時(shí)接種兩個(gè)平板。
6.1.2.2.5 結果解釋
非目標菌的生長(cháng)指數G—般小于或等于1，至少應達到小于5
6.1.2.3非目標菌(特異性)定性測試方法
6.1.2.3.1平板的制備與保存
按照6.1.1.1中要求進(jìn)行。
6.1.2.3.2 工作菌懸液的制備
6.1.2.3.3 按照6.1.1.2中要求進(jìn)行。
6.1.2.3.4 接種
用1 μL接種環(huán)取測試菌培養物在測試培養基表面劃平行直線(xiàn)。并按標準規定的培養條件培養平板。
6.1.2.3.5 結果解釋
非目標菌應有典型的菌落外觀(guān)、大小和形態(tài)。 6.1.3非選擇性增菌培養基的半定量測試方法 6.1.3.1培養基的制備
將培養基分裝試管，每管10 mL
6.1.3.2 工作菌懸液的制備
將標準儲備菌株接種到非選擇性肉湯培養過(guò)夜或采用其他制備方法，制備10倍系列稀釋的菌懸液。
6.1.3.2 接種
在裝有待測培養基的試管中接種10 CFU〜100 CFU的目標菌，每管接種量為1 mL，接種兩個(gè)平行 管。同時(shí)將1 mL菌懸液（與試管接種同一稀釋度）傾注平板，接種兩個(gè)平板，作接種量計數用。按標 準方法中規定的培養時(shí)間和溫度進(jìn)行培養（如增菌時(shí)間為8 h以下，需取10 μL培養后的增菌液傾注到 適合的培養基中，再按適合的培養時(shí)間和溫度進(jìn)行培養）。
6.1.3.3 結果解釋
用目測的濁度值（如0〜2)評估培養基：
——0表示無(wú)混濁；
—1表示很輕微的混濁；
——2表示嚴重的混濁。
目標菌的濁度值應為2
有時(shí)可以觀(guān)察到微生物生長(cháng)后聚集成細胞團，沉積在試管或瓶子底部，發(fā)生這種情況時(shí)，小心振 蕩試管后再進(jìn)行觀(guān)察。
如增菌8 h以下，10 μL增菌液培養計數結果參照附錄D培養基質(zhì)量控制標準。
6.1.4選擇性增菌培養基的半定量測試方法
6.1.4.1培養基的制備
將培養基分裝試管，每管10 mL
6.1.4.2 工作菌懸液的制備
按照6.1.3.2中要求進(jìn)行。
6.1.4.3 接種
6.1.4.3.1混合菌的接種
在裝有待測培養基的試管中接種10 CFU〜100 CFU的目標菌（特殊接菌量參照附錄D培養基質(zhì) 量控制標準），并接種1000 CFU〜5000 CFU的非目標菌，接種總量為1 mL，同時(shí)接種兩個(gè)平行管， 混勻。同時(shí)分別將目標菌菌懸液（與試管接種同一稀釋度）和非目標菌菌懸液（比試管接種小10〜100 倍稀釋度）1mL傾注平板，接種兩個(gè)平板，作接種量計數用。按標準方法中規定的培養時(shí)間和溫度進(jìn) 行培養。
6.1.4.3.2非目標菌的接種
在裝有待測培養基的試管中接種1000 CFU〜5000 CFU的非目標菌，接種量為1 mL，同時(shí)接種兩 個(gè)平行管，混勻。按標準方法中規定的培養時(shí)間和溫度進(jìn)行培養。
6.1.4.4 培養液的接種
6.1.4.4.1 混合菌培養液的接種
用10 μL接種環(huán)取1環(huán)經(jīng)培養后的混合菌培養液，劃線(xiàn)接種到特定的選擇性平板上，同時(shí)每管接 種一個(gè)平板。按標準方法中規定的培養時(shí)間和溫度進(jìn)行培養。
6.1.4. 4.2非目標菌培養液的接種
吸取10 μL經(jīng)培養后的非目標菌培養液，均勻涂布接種到非選擇性平板（如TSA)上。同時(shí)每管 接種一個(gè)平板�？墒褂脙A注法進(jìn)行接種，并按標準規定的培養條件培養平板。
6.1.4.5 計算和結果解釋
目標菌在選擇性平板上的菌落應>10 CFU，則表示待測液體培養基的生長(cháng)率良好；非目標菌在非 選擇性平板上的菌落數應<100 CFU，則表示待測液體培養基的選擇性為良好。
6.1.5選擇性液體計數培養基的半定量測試方法
6.1.5.1培養基的制備
將培養基分裝試管，每管10 mL
6.1.5.2 工作菌懸液的制備
按照6.1.3.2中要求進(jìn)行。
6.1.5.2 接種
6.1.5.3 6.1.5.3.1目標菌的接種
在裝有待測培養基的試管中接種10 CFU〜100 CFU的目標菌，接種總量為1 mL，同時(shí)接種兩個(gè) 平行管，混勻。同時(shí)將1 mL菌懸液(與試管接種同一稀釋度))傾注平板，接種兩個(gè)平板，作接種量計數 用。按標準方法中規定的培養時(shí)間和溫度進(jìn)行培養。
6.1.5.3.2非目標菌的接種
在裝有待測培養基的試管中接種1000 CFU〜5000 CFU的非目標菌，接種總量為1 mL，同時(shí)接種
兩個(gè)平行管，混勻。同時(shí)將1 mL菌懸液(比試管接種小10〜100倍稀釋度)傾注平板，接種兩個(gè)平板， 作接種量計數用。按標準方法中規定的培養時(shí)間和溫度進(jìn)行培養。
6.1.5.4 結果解釋
用目測的濁度值(如0〜2)評估培養基：
——0表示無(wú)混濁；
—1表示很輕微的混濁；
——2表示嚴重的混濁。
并記錄小導管收集氣體的體積比。
目標菌的濁度值應為2，產(chǎn)氣應為1/3或以上；非目標菌的濁度值應為0或1，無(wú)產(chǎn)氣現象。
注：有時(shí)可以觀(guān)察到微生物生長(cháng)后聚集成細胞團，沉積在試管或瓶子底部，發(fā)生這種情況時(shí)，小心振蕩試管后再 進(jìn)行觀(guān)察。
6.1.6懸浮培養基和運輸培養基的定量測試方法
6.1.6.1培養基的制備
將培養基分裝試管，每管10 mL(有特殊要求的可選用5 mL)
6.1.6.2目標、菌工作菌懸液的制備
按照6.1.3.2中要求進(jìn)行。
6.1.6.3 接種
在裝有待測培養基的試管中接種100 CFU〜1000 CFU的目標菌，同時(shí)接種兩個(gè)平行管，混勻后， 立即吸取1 mL待測培養基混合液，參照附錄F培養基質(zhì)量控制標準選用相應的培養基傾注平板，每管 待測培養基接種一個(gè)平板。按標準方法中規定的培養時(shí)間和溫度培養后，進(jìn)行菌落計數。
剩余已接種菌液的待測培養基置20℃~25℃放置45min后；再吸取1 mL傾注平板，每管培養基接 種一個(gè)平板，按標準方法中規定的培養時(shí)間和溫度培養后，進(jìn)行菌落計數。如保存條件有特殊要求的 待測培養基，參照附錄F培養基質(zhì)量控制標準要求放置或培養后再進(jìn)行菌落計數。
6.1.6.4結果觀(guān)察與解釋
待測培養基中的菌落數變化應在± 50%內。
6.1.7 Mueller-Hinton血瓊脂的紙片擴散測試方法（定性測試方法）
6.1.7.1平板的制備與保存
傾注融化的培養基到平皿中，使之在平皿中形成一個(gè)厚度為4 mm〜5 mm的瓊脂層。傾注后將平 板放到水平平面，使瓊脂冷卻凝固。凝固后的培養基應立即使用或存放于暗處和（或）5 C±3 C冰箱 的密封袋中，在有效期內使用。使用前應可將平板置35 C溫箱中或置室溫層流櫥中對瓊脂表面進(jìn)行干 燥，培養基表面應濕潤，但不能有水滴，培養皿也不應有水滴。
6.1.7.2質(zhì)控菌株的復蘇
將質(zhì)控菌株接種到血平板上，按標準方法中規定的培養時(shí)間和溫度進(jìn)行培養。檢查純度合格后， 用于質(zhì)控工作菌懸液的制備。
6.1.7.3 質(zhì)控菌工作菌懸液的制備
將純度滿(mǎn)意的質(zhì)控菌株培養物懸浮于TSB肉湯中，并調整濁度為0.5麥氏標準（約1x108 CFU/mL〜 2x108CFU/mL)。
6.1.7.4 接種
用涂布法將質(zhì)控工作菌懸液接種于MH平板上，并貼上相應的抗生素紙片(每平板最多貼6片))，將 平板翻轉后按標準方法中規定的培養時(shí)間和溫度進(jìn)行培養。調整菌懸液濁度與接種所有平板間的時(shí)間 間隔不要超過(guò)15 min
6.1.7.5結果觀(guān)察與解釋
在無(wú)反射黑色背景下，觀(guān)察有無(wú)抑菌環(huán)。結果解釋參照參照附錄D表D.7。 6.1.8鑒定培養基的測試方法
6.1.8.1 液體培養基
6.1.8.1.1 培養基的制備
將培養基分裝試管，再進(jìn)行滅菌和添加試劑。
6.1.8.1.2 工作菌懸液的制備
將標準儲備菌株接種到非選擇性肉湯中或采用其他制備方法，制備成5 McFarland濁度（約109 CFU/mL)的菌懸液。
6.1.8.1.3 接種
吸取0.05 mL〜0.08 mL (約1〜2滴）至待測培養基內，按標準方法中規定的培養時(shí)間和溫度進(jìn)行
培養。
6.1.8.1.4 結果觀(guān)察與解釋
需加指示劑的試驗在微生物生長(cháng)良好的情況下，按順序加入指示劑，再觀(guān)察結果。結果解釋參照 附錄D表D.8
6.1.8.2 半固體培養基
6.1.8.2.1培養基的制備
將培養基分裝試管。滅菌后豎立放置，冷卻后備用。
6.1.8.2.2 接種
取新鮮質(zhì)控菌株斜面，用接種針挑取菌苔穿刺接種至待測培養基內。按標準方法中規定的培養時(shí) 間和溫度進(jìn)行培養。
6.1.8.2.3 結果觀(guān)察與解釋
需加指示劑的試驗在微生物生長(cháng)良好的情況下，按順序加入指示劑，再觀(guān)察結果。結果解釋參照 附錄D表D.8
6.1.8.3高層斜面培養基和斜面培養基
6.1.8.3.1 培養基的制備
將培養基分裝試管。滅菌后擺放成高層斜面（斜面與底層高度約為2:3)和普通斜面（斜面與底層 高度約為3:2)，冷卻后備用。
6.1.8.3.2 接種
高層斜面培養基：取新鮮質(zhì)控菌株斜面，用接種針挑取菌苔穿刺接種至瓊脂高層，穿刺接種完畢 后，再在斜面上劃“之”字形接種；斜面培養基：取新鮮質(zhì)控菌株斜面，用接種環(huán)挑取菌苔在斜面上 劃“之”字形接種。按標準方法中規定的培養時(shí)間和溫度進(jìn)行培養。
6.1.8.3.3 結果觀(guān)察與解釋
需加指示劑的試驗在微生物生長(cháng)良好的情況下，按順序加入指示劑，再觀(guān)察結果。結果解釋參照 附錄D表D.8
6.1.8.4 平板培養基
6.1.8.4.1培養基的制備
傾注滅菌融化的培養基到平皿中，使之在平皿中形成一個(gè)至少3 mm厚的瓊脂層（直徑90 mm的平 皿通常要加入18 mL〜20 mL瓊脂培養基）。
6.1.8.4.2 接種
取新鮮質(zhì)控菌株斜面，用接種環(huán)挑取菌苔在平板上劃“之”字形接種，或用接種針挑取菌苔在平 板上點(diǎn)種接種。按標準方法中規定的培養時(shí)間和溫度進(jìn)行培養。
6.1.8.4.3 結果觀(guān)察與解釋
參照附錄D表D.8
6.1.9實(shí)驗試劑的測試方法
6.1.9.1實(shí)驗方法
按試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。
6.1.9.2 結果觀(guān)察與解釋
6.1.9.3 參照附錄D表D.8
