神經(jīng)干細胞的培養

一、  神經(jīng)干細胞的分離

無(wú)菌條件下取新生SD大鼠（出生48h內）腦組織，D-Hanks液充分漂洗后，在解剖顯微鏡下剝離腦膜，準確分離海馬，用眼科剪將海馬剪碎后，再轉移到DMEM/F12（1:1）加B27 和bFGF（20ng/ml）的無(wú)血清培養基，吸管吹打機械分離制作單細胞懸液，臺盼藍染色后細胞計數，調整細胞濃度為5×104~5個(gè)/ml，置于24孔培養板中培養，每孔加入細胞懸液500μl。待神經(jīng)球形成后再次機械分離克隆制作單細胞懸液，仍以5×104個(gè)/ml的細胞濃度置于24孔培養板中培養，每孔加入細胞懸液500μl。此后每7d機械分離克隆傳代1次，方法同前。

 

二、BrdU標記

將BrdU溶于無(wú)血清培養基，過(guò)濾除菌后加入神經(jīng)球形成后再次機械分離克隆制作的單細胞懸液中（BrdU終濃度為5μmol/L），培養7d待新的神經(jīng)球形成后，將神經(jīng)球轉移到預先涂布有多聚賴(lài)氨酸的培養板中，貼壁2h行BrdU免疫細胞化學(xué)染色。

 

三、  神經(jīng)干細胞的誘導分化

選取部分上述傳代后形成的次代神經(jīng)球種植于預先涂布有多聚賴(lài)氨酸的24孔培養板中，并加入有血清培養基（含10％胎牛血清的DMEM/F12），一部分神經(jīng)球于貼壁2h后行Nestin免疫細胞化學(xué)染色，另一部分神經(jīng)球繼續培養，觀(guān)察其生長(cháng)分化情況。另將一部分次代神經(jīng)球機械分離制成單細胞懸液后加入有血清培養基貼壁培養，7d后分別行Tuj1 、GFAP 、Galc 免疫細胞化學(xué)染色。

 

四、  條件培養液的制備

取1g雞胚的后肢骨骼肌組織，加入9mlD-Hanks液中冰浴勻漿15min，離心獲得上清液，過(guò)濾除菌后，加兩倍體積DMEM/F12培養基制成條件培養液備用。

 

五、  神經(jīng)干細胞的定向誘導分化

將一部分次代神經(jīng)球機械分離制成單細胞懸液后分別加入條件培養液和有血清培養基（含10％胎牛血清的DMEM/F12）中對照貼壁培養，7d后均行ChAT免疫細胞化學(xué)染色。

 

六、  免疫細胞化學(xué)染色

培養細胞用4％多聚甲醛固定30min后，PBS充分漂洗，然后按ABC法分別行鼠抗Nestin，鼠抗Tuj1，兔抗GFAP，鼠抗Galc，鼠抗Brdu免疫細胞化學(xué)染色，用DAB和H2O2作為呈色劑，陽(yáng)性著(zhù)色為棕黃色。具體方法為：

（1） 0.05M PBS漂洗 10min×3次

（2） 0.3%H2O2/0.05M PBS室溫 30min

（3） 0.3%Triton-100/0.05M PBS 37 ℃，15min

（4） 0.05M PBS漂洗 10min×3次

（5） 5%羊血清/0.05M PBS 37 ℃，15min

（6） I抗（2%羊血清/0.05M PBS配） 4℃，48h

（7） 0.05M PBS漂洗 10min×3次

（8） II抗（2%羊血清/0.05M PBS配，1：200） 37 ℃，1.5h

（9） 0.05M PBS漂洗 10min×3次

（10） AB復合物（0.05M PBS配，1：100） 37 ℃，1.5h

（11） 0.05M PBS漂洗 10min×3次

（12） Tris-HCl緩沖液 37 ℃，15min

（13） DAB顯色 20min

（14） 蒸餾水漂洗 10min×3次

 

然后，為進(jìn)一步證明實(shí)驗組的細胞是膽堿能神經(jīng)元，將已作完ChAT免疫細胞化學(xué)染色的細胞用PBS終止顯色以及進(jìn)一步封閉非特異性結合位點(diǎn)后， 仍用ABC法行Tuj1免疫細胞化學(xué)染色，用含有NiCl的DAB和H2O2作為呈色劑,雙標陽(yáng)性細胞著(zhù)色為藍黑色。