鏈霉菌原生質(zhì)體的轉化

鏈霉菌原生質(zhì)體的轉化 1. 將最多5 ul的DNA（質(zhì)�；蛎高B產(chǎn)物）加于已經(jīng)裝有50 ul原生質(zhì)體的指型管（1.5 ml）的管壁上（不與原生質(zhì)體接觸）。 2. 吸取200ul的25% PEG4000（PEG應先滅菌，再用P Buffer配置），將DNA沖入原生質(zhì)體中，小心抽吸幾次使之混勻。 3. 將混合物涂布于R5平板上（不含任何抗生素）。 4. 30度培養14~20 hr后（待原生質(zhì)體再生后，即平板呈霧狀），用含有適當抗生素的1 ml無(wú)菌水溶液覆蓋。 5. 再培養1~2 d后，可以看到小的轉化子菌落長(cháng)出。 PCR-Targeting技術(shù)中E.coli電轉化感受態(tài)的制備及電轉化 1. 將天藍色鏈霉菌庫斯質(zhì)粒轉化進(jìn)入大腸桿菌BW25113/pIJ790*菌株中，此步可用常規的CaCl2 法。（pIJ790帶有cat基因和對溫度敏感的復制區，培養時(shí)溫度要嚴格控制在30゜C以下） 2. 培養含庫斯質(zhì)粒的BW25113/pIJ790菌株：從平板上挑取大腸桿菌單菌落接入5ml 含25ug/ml Cml,100ug/ml Amp的SOB-MgSO4 （不加MgCl2 的SOB中加入MgSO4至20mM ）中，30゜C搖床培養過(guò)夜。 3. 取一部分過(guò)夜培養物至25ml新鮮的SOB-MgSO4 培養基（含25ug/ml Cml,100ug/ml Amp）中，菌體終濃度為1% ，添加250ul 1M L-阿拉伯糖誘導λ/red 重組系統。 4. 30゜C ，200rpm搖床培養3-5h 至OD600~0.6 。 5. 將培養物倒入預冷的30ml離心管中，冰上置10min(從此細胞溫度要保持在0~4゜C)。4000rpm 4゜C離心 5min。 6. 棄掉上清，加1ml預冷的10%甘油，在冰上打散沉淀，再加9ml 10%甘油,搖勻。 7. 4000rpm 4゜C離心 5min，棄掉上清，用10%甘油洗滌。重復上面操作：4000rpm 4゜C離心5min，盡量棄去上清，用殘留液將細胞打散。（感受態(tài)細胞濃度越高電轉效果越好） 8. 在預冷的0.2cm的電轉化杯中混合50ul感受態(tài)細胞與1-2ul PCR產(chǎn)物（經(jīng)純化，可盡量濃，但不能加得過(guò)多），混勻后立即電擊，電擊條件：200Ω,25uF,2.5kv, 電擊結果為4.5~4.9ms 較理想。（電轉化杯在70％乙醇中保存，用前先在無(wú)菌環(huán)境下用無(wú)水乙醇洗一下，再吹干，放冰上預冷，無(wú)水乙醇能加快吹干的速度。也可以選擇0.1cm的電轉化杯，但電擊的參數就得變?yōu)椋?.8 kV，？Ω,?uF） 9. 立即加1ml預冷的SOC，37゜C誘導培養40min（如需在同一庫斯質(zhì)粒上中斷基因，則30゜C誘導培養）。 10. 涂LA（含100ug/ml Amp及與電轉片段攜帶的抗性標記相應的抗生素）平板，37゜C過(guò)夜培養。（轉化子中含有兩種質(zhì)粒，分別是重組前和重組后的質(zhì)粒，所以要抽質(zhì)粒再轉化一次DH5）

 

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