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我國幅員遼闊，各地氣候條件、土質(zhì)條件、植被條件差異很大，這為自然界中各種微生物的存在提供了良好的生存環(huán)境。自然界中微生物種類(lèi)繁多，估計不少于幾十萬(wàn)種，但目前已為人類(lèi)研究及應用的不過(guò)千余種。由于微生物到處都有，無(wú)孔不入，所以它們在自然界大多是以混雜的形式群居于一起的。而現代發(fā)酵工業(yè)是以純種培養為基礎，故采用各種不同的篩選手段，挑選出性能良好、符合生產(chǎn)需要的純種是工業(yè)育種的關(guān)鍵一步。自然界工業(yè)菌種分離篩選的主要步驟是：采樣、增殖培養、培養分離和篩選。如果產(chǎn)物與食品制造有關(guān)，還需對菌種進(jìn)行毒性鑒定。
1. 采樣
以采集土壤為主。一般在有機質(zhì)較多的肥沃土壤中，微生物的數量最多，中性偏堿的土壤以細菌和放線(xiàn)菌為主，酸性紅土壤及森林土壤中霉菌較多，果園、菜園和野果生長(cháng)區等富含碳水化合物的土壤和沼澤地中，酵母和霉菌較多。采樣的對象也可以是植物，腐敗物品，某些水域等。采樣應充分考慮采樣的季節性和時(shí)間因素，以溫度適中，雨量不多的秋初為好。因為真正的原地菌群的出現可能是短暫的，如在夏季或冬季土壤中微生物存活數量較少，暴雨后土壤中微生物會(huì )顯著(zhù)減少。采樣方式是在選好適當地點(diǎn)后，用無(wú)菌刮鏟、土樣采集器等，采集有代表性的樣品，如特定的土樣類(lèi)型和土層，葉子碎屑和腐質(zhì)，根系及根系周?chē)鷧^域，海底水，泥及沉積物，植物表皮及各部，陰溝污水及污泥，反色動(dòng)物第一胃內含物，發(fā)酵食品等。
具體采集土樣時(shí)，就森林、旱地、草地而言，可先掘洞，由土壤下層向上層順序采集；就水田等浸水土壤而言，一般是在不損土層結構的情況下插入圓筒采集。如果層次要求不嚴格，可取離地面5~15cm處的土。將采集到的土樣盛入清潔的聚乙烯袋、牛皮袋或玻璃瓶中。采好的樣必須完整地標上樣本的種類(lèi)及采集日期、地點(diǎn)以及采集地點(diǎn)的地理、生態(tài)參數等。采好的樣品應及時(shí)處理，暫不能處理的也應貯存于4℃下，但貯存時(shí)間不宜過(guò)長(cháng)。這是因為一旦采樣結束，試樣中的微生物群體就脫離了原來(lái)的生態(tài)環(huán)境，其內部生態(tài)環(huán)境就會(huì )發(fā)生變化，微生物群體之間就會(huì )出現消長(cháng)。如果要分離嗜冷菌，則在室溫下保存試樣會(huì )使嗜冷菌數量明顯降低。
在采集植物根際土樣時(shí)，一般方法是將植物根從土壤中慢慢拔出，浸漬在大量無(wú)菌水中約20min，洗去粘附在根上的土壤，然后再用無(wú)菌水漂洗下根部殘留的土，這部分土即為根際土樣。
在采集水樣時(shí)，將水樣收集于100m1干凈、滅菌的廣口塑料瓶中。由于表層水中含有泥沙，應從較深的靜水層中采集水樣。方法是：握住采樣瓶浸入水中30~50cm處，瓶口朝下打開(kāi)瓶蓋，讓水樣進(jìn)入。如果有急流存在的話(huà)，應直接將瓶口反向于急流。水樣采集完畢時(shí)，應迅速從水中取出采集瓶并帶有較大的弧度。水樣不應裝滿(mǎn)采樣瓶，采集的水樣應在24h之內迅速進(jìn)行檢測，或者4℃下貯存。
2. 增殖培養
一般情況下，采來(lái)的樣品可以直接進(jìn)行分離，但是如果樣品中我們所需要的菌類(lèi)含量并不很多，而另一些微生物卻大量存在。此時(shí)，為了容易分離到所需要的菌種，讓無(wú)關(guān)的微生物至少是在數量上不要增加，即設法增加所要菌種的數量，以增加分離的幾率�？梢酝ㄟ^(guò)選擇性的配制培養基(如營(yíng)養成分、添加抑制劑等)，選擇一定的培養條件(如培養溫度、培養基酸堿度等)來(lái)控制。具體方法是根據微生物利用碳源的特點(diǎn)，可選定糖、淀粉、纖維素，或者石油等，以其中的一種為唯一碳源，那么只有利用這一碳源的微生物才能大量正常生長(cháng)，而其他微生物就可能死亡或淘汰。對G一菌有選擇的培養基(如結晶紫營(yíng)養培養基、紅—紫膽汁瓊脂、煌綠膽汁瓊脂等)通常含有5%~10%的天然提取物。在分離細菌時(shí)，培養基中添加濃度一般為50μg／m1的抗真菌劑(如放線(xiàn)菌酮和制霉素)，可以抑制真菌的生長(cháng)。在分離放線(xiàn)菌時(shí)，通常于培養基中加入1~5m1天然浸出汁(植物、巖石、有機混合腐質(zhì)等的浸出汁) 作為最初分離的促進(jìn)因子，由此可以分離出更多不同類(lèi)型的放線(xiàn)菌類(lèi)型；放線(xiàn)菌還可以十分有效地利用低濃度的底物和復雜底物(如幾丁質(zhì))，因此，大多數放線(xiàn)菌的分離培養是在貧脊或復雜底物的瓊脂平板上進(jìn)行的，而不是在含豐富營(yíng)養的生長(cháng)培養基上分離的；在放線(xiàn)菌分離瓊脂中通常加入抗真菌劑制霉菌素或放線(xiàn)菌酮，以抑制真菌的繁殖；此外，為了對某些特殊種類(lèi)的放線(xiàn)菌進(jìn)行富集和分離，可選擇性地添加一些抗生素(如新生霉素)。在分離真菌時(shí)，利用低碳／氮比的培養基可使真菌生長(cháng)菌落分散，利于計數、分離和簽定；在分離培養基中加入一定的抗生素如氯霉素、四環(huán)素、卡那霉素、青霉素、鏈霉素等即可有效地抑制細菌生長(cháng)及其菌落形成；抑制細菌的另外一些方法有：在使用平皿之前，將平皿先干燥3~4天；降低培養基的pH值或在無(wú)法降低pH時(shí)，加入1：30000玫瑰紅。這樣有利于下階段的純種分離。
3. 培養分離
通過(guò)增殖培養，樣品中的微生物還是處于混雜生長(cháng)狀態(tài)。因此還必須分離，純化。在這一步，增殖培養的選擇性控制條件還應進(jìn)一步應用，而且要控制得細一點(diǎn)，好一點(diǎn)。同時(shí)必須進(jìn)行純種分離，常用的分離方法有稀釋分離法、劃線(xiàn)分離法和組織分離法。稀釋分離法的基本方法是將樣品進(jìn)行適當稀釋?zhuān)缓髮⑾♂屢和坎加谂囵B基平板上進(jìn)行培養，待長(cháng)出獨立的單個(gè)菌落，進(jìn)行挑選分離。劃線(xiàn)分離法要首先倒培養基平板，然后用接種針(接種環(huán))挑取樣品，在平板上劃線(xiàn)。劃線(xiàn)方法可用分步劃線(xiàn)法或一次劃線(xiàn)法，無(wú)論用哪種方法，基本原則是確保培養出單個(gè)菌落。組織分離法主要用于食用菌菌種或某些植物病原菌的分離。分離時(shí)，首先用10%漂白粉或0.1%升汞液對植物或器官組織進(jìn)行表面消毒，用無(wú)菌水洗滌數次后，移植到培養皿中的培養基上，于適宜溫度培養數天后，可見(jiàn)微生物向組織塊周?chē)鷶U展生長(cháng)。經(jīng)菌落特征和細胞特征觀(guān)察確認后，即可由菌落邊緣挑取部分菌種進(jìn)行移接斜面培養。
對于有些微生物如毛霉、根霉等在分離時(shí)，由于其菌絲的蔓延性，極易生長(cháng)成片，很難挑取單菌落。常在培養基中添加0.1%的去氧膽酸鈉或在察氏培養基中添加0.1%的山梨糖及0.01%的蔗糖，利于單菌落的分離。
4. 篩選
經(jīng)過(guò)分離培養，在平板上出現很多單個(gè)菌落，通過(guò)菌落形態(tài)觀(guān)察，選出所需菌落，然后取菌落的一半進(jìn)行菌種鑒定，對于符合目的菌特性的菌落，可將之轉移到試管斜面純培養。這種從自然界中分離得到的純種稱(chēng)為野生型菌株，它只是篩選的第一步，所得菌種是否具有生產(chǎn)上的實(shí)用價(jià)值，能否作為生產(chǎn)菌株，還必須采用與生產(chǎn)相近的培養基和培養條件，通過(guò)三角瓶的容量進(jìn)行小型發(fā)酵試驗，以求得適合于工業(yè)生產(chǎn)用菌種。這一步是采用與生產(chǎn)相近的培養基和培養條件，通過(guò)三角瓶的容量進(jìn)行小型發(fā)酵試驗，以求得適合于工業(yè)生產(chǎn)用菌種。如果此野生型菌株產(chǎn)量偏低，達不到工業(yè)生產(chǎn)的要求，可以留之作為菌種選育的出發(fā)菌株。
5. 毒性試驗
自然界的一些微生物在一定條件下將產(chǎn)生毒素，為了保證食品的安全性，凡是與食品工業(yè)有關(guān)的菌種，除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草桿菌無(wú)須作毒性試驗外，其他微生物均需通過(guò)兩年以上的毒性試驗。
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